γδT细胞在小鼠沙眼衣原体呼吸道感染中的保护作用及机制-基础医学专业论文.docxVIP

万方数据 万方数据 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是我个人在导师指导下独立进行研究工作取 得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容和致谢的地方外，论文中不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名： 日期： 年 月 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解天津医科大学有关保留、使用学位论文的规定， 即：学校有权将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有 关部门或机构送交论文，并编入有关数据库。 本论文属于 保密 ，在 年解密后适用本授权书。 不保密 。 （请在相对应的方框内打“√” ） 学位论文作者签名： 日期： 年 月 日 导 师 签 名 ： 日期： 年 月 日 天津 天津医科大学硕士学位论文 研究背景： 中文摘要 衣原体(chlamydia)是一类严格的细胞内寄生菌，沙眼衣原体（Chlamydia trach omatis，Ct）是引起人类疾病的主要衣原体菌株，可引起沙眼、肺炎及性传播疾 病，通过性接触传播引起泌尿生殖系统炎症，并可继发不孕、不育等并发症， 对人类健康危害极大。由于对这一胞内寄生菌诱导的复杂的宿主免疫反应机制 缺乏更全面、细致的了解，目前尚没有有效的疫苗用于衣原体感染的预防。对 衣原体感染宿主免疫保护机制的深入研究对有效预防和临床治疗衣原体感染疾 病有十分重要的意义。前期的研究已证实，αβT细胞介导的细胞免疫应答，尤其 是CD3+CD4+T细胞分泌的IFNγ和IL-17 在宿主抗衣原体感染中发挥重要保护作 用。γδT细胞是参与先天性免疫应答的细胞，活化后分泌IFN-γ、GM-CSF等细胞 因子，调节其它免疫细胞功能，桥联先天性和获得性免疫。γδT细胞在感染早期 能够产生大量的IL-17A介导疾病的发生发展，这一功能日益受到关注。 目的： 利用沙眼衣原体小鼠肺炎菌株（Cm）呼吸道感染模型探讨γδT细胞在沙眼衣 原体呼吸道感染中的增殖、活化及细胞因子的产生；利用γδT细胞基因敲除小鼠 探讨γδT细胞在沙眼衣原体呼吸道感染中的作用以及对衣原体特异性的适应性 免疫应答的调节。 方法： WT 小鼠（C57BL/6 鼠）鼻腔吸入 1×103 IFU 沙眼衣原体小鼠肺炎菌株 （Cm），建立小鼠沙眼衣原体肺炎模型。为了确定γδT 细胞的增殖、活化及细 胞因子分泌，在 Cm 感染的不同时间点处死小鼠，分离小鼠脾及肺组织单个核细 胞，用荧光标记的抗鼠 CD3、TCRγδ及 CD69 抗体染色，流式细胞仪检测 WT 小鼠肺及脾组织 CD3+TCRγδ+T 细胞百分率及细胞数，确定 Cm 感染诱导γδT 细 胞的增殖；检测 CD3+TCRγδ+T 细胞表面 CD69 表达水平，确定 Cm 感染诱导γδT 细胞的活化；利用细胞内细胞因子染色技术检测 Cm 感染不同时间点肺组织 CD3+TCRγδ+T 细胞细胞因子 IFNγ和 IL-17 的分泌水平。为了进一步确定γδT 在 衣原体肺炎中的作用，用上述方法分别感染 WT 小鼠（C57BL/6 ）和 TCRδ-/-小 I 鼠（C57BL/6 γδT KO 鼠），每天监测两种小鼠体重变化；制备感染后不同时间 点小鼠肺组织匀浆，体外感染 Hep2 细胞，用酶免疫法染色衣原体包涵体，计数 包涵体形成单位（IFU）以确定感染小鼠肺组织衣原体繁殖水平；感染小鼠肺组 织进行 HE 染色确定 Cm 感染诱导的肺组织炎症。为了确定γδT 细胞对宿主抗 衣原体特异性免疫应答的影响，用 ELISA 法测定脾脏单个核细胞培养上清中 IFNγ、IL-4 及 IL-17 的产生；进一步采用细胞内细胞因子染色技术测定小鼠肺组 织中 CD3+CD4+T 细胞 IFNγ（Th1 免疫应答）、CD3+CD4+T 细胞 IL-4（Th2 免 疫应答）及 CD3+CD4+T 细胞 IL-17（Th17 免疫应答）水平，确定γδT 细胞对宿 主抗衣原体 Th1、Th2、Th17 免疫应答的调节作用。 结果： 一定剂量的 Cm 经呼吸道感染诱导小鼠衣原体肺炎。与未感染的对照组（第 0 天）比较，Cm 感染诱导小鼠肺及脾组织 CD3+TCRγδ+T 细胞百分率及肺组织 γδT 细胞总数逐渐升高，于感染后第 7 天达到高峰，随后逐渐下降。肺组织 CD3+TCRγδ+T 细胞表面活化标志分子 CD69 检测结果显示，与未感染组相比， CD69 表达于感染后第 3 天达到高峰，此后略有降低。以上结果提示，Cm 呼吸 道感染诱导γδT 细胞在感染部位及外周免疫器官聚集及活化。进一步对γδT 细胞 产生的细胞因子进