ZFP580在ROS介导的心肌细胞氧化应激损 伤中的作用-心血管内科专业论文.docxVIP

万方数据 万方数据 目 录 中文摘要…………………………………………………………………1 英文摘要…………………………………………………………………4 英文缩写…………………………………………………………………8 研究论文 ZFP580 在 ROS 介导的心肌细胞氧化应激损伤中的作用 前言 ………………………………………………………………10 材料方法 …………………………………………………………10 结果 ………………………………………………………………24 附图 ………………………………………………………………28 附表 ………………………………………………………………35 讨论 ………………………………………………………………38 结论 ………………………………………………………………39 参考文献 …………………………………………………………40 综述 氧化应激及活性氧自由基在心血管疾病中的作用…………43 致谢………………………………………………………………………55 个人简历…………………………………………………………………56 中 中 文 摘 要 PAGE 10万方数据 PAGE 10 万方数据 ZFP580 在 ROS 介导的心肌细胞氧化应激损伤中的作用 摘 要 目的：氧化应激(oxidative stress)是由于机体活性氧(Reactive oxygen species, ROS)产生增多与抗氧化系统之间平衡失调应起的一系列适应性 的反应。对人类而言，氧化应激涉及许多疾病，如帕金森氏病和阿兹海默 病等。在心血管系统疾病中，如心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia / reperfusion injury，MI/RI) 、动脉粥样硬化及高血压等均发生了氧化应激 损伤。而 ROS 作为氧化应激的核心成分，在该过程中起到至关重要的作 用。ROS 既可以直接引起组织细胞损伤，又可以通过有关信号转导通路， 如 MAPK 通路、NF-KB 通路等间接引起生物学效应。近年来，MAPK 通 路在氧化应激中的作用日益受到关注。本组在前期的研究工作中筛选人主 动脉 cDNA 文库，得到一个 cDNA 全长为 1726bp 的锌指蛋白新基因 ZNF580。该基因编码 172 个氨基酸组成的蛋白质，其 N 端为脯氨酸富含 域，C 端为含有三个串联重复的 C2H2 型锌指蛋白结构域，其蛋白结构与 Sp/KLF 家族成员相似。ZFP580 是本试验室随后克隆的与 ZNF580 同源的 鼠源性基因。本组通过前期实验已经发现，H2O2 可以诱导 ZNF580 表达 升高，且 ZNF580 可以受到 NF-KB 及 P38 MAPK 通路的调节。故本实验 旨在通过 H2O2 体外刺激 H9C2 大鼠心肌细胞探讨 ZFP580 在 ROS 介导的 心肌细胞氧化应激损伤中的作用。 方法:使用不同剂量 H2O2 刺激 H9C2 细胞不同时间，筛选适宜的刺激 浓度及时间，对照组加入等量的 DMEM 培养基。MTT 法检测细胞活性； 检测细胞上清中 LDH 活性； Realtime-PCR 测定 ZFP580、IL-6 及 TNF-α mRNA 表达水平；Western-blot 检测 ZFP580、P38 MAPK、phospho- P38 MAPK、caspase3 及 cleaved-caspase3 的蛋白表达；使用慢病毒过表达 ZFP580 后利用流式细胞术检测细胞凋亡情况；通过 p38MAPK 的特异性 阻滞剂 SB303580 观察 P38 MAPK 磷酸化对 H2O2 诱导 ZFP580 表达的影 响。 结果： (1)适宜 H2O2 刺激浓度的选定：根据文献选取 H2O2 200 μmol/L 为刺 激浓度，分别刺激 H9C2 细胞 30min、1h、2h，4h、6h，对照组加入等量 的 DMEM 培养基。MTT 结果发现 H2O2 200 μmol/L 刺激 2h，4h、6h 后 细胞活性明显减低与对照组相比有统计学差异(P 0.05)。以 H2O2 刺激 2h 为时间节点，分别以 100 μmol/L、200μmol/L、400 μmol/L、800 μmol/L 刺激 H9C2 细胞，发现随刺激浓度的增加细胞活性明显减低，与对照组相 比具有统计学差异 (P ＜0.05)。而以 H2O2 200 μmol/L 刺激 H9C2 细胞 15min、30min、1h、2h 后，分别检测细胞上清 LDH 活性，结果发现与对 照相比 H2O2 200 μmol/L 刺激 15min 后即可造成细胞损伤。故后续实验 H2O2 刺激浓度为 200 μmol/L 时间选定为 2h 以内。