小半夏加茯苓汤醇提物对BGC―823细胞线粒体凋亡通路影响.docVIP

小半夏加茯苓汤醇提物对BGC―823细胞线粒体凋亡通路影响 　　【摘要】目的： 观察小半夏加茯苓汤醇提物对胃癌细胞BGC-823的凋亡作用以及诱导其凋亡发生的机制。方法：运用MTT法检测不同浓度的小半夏加茯苓汤醇提物对BGC-823的增殖抑制作用并计算抑制率；以罗丹明123为细胞染色剂，采用流式细胞术检测线粒体跨膜电位的改变；实时荧光定量PCR检测Bax、Bcl-2和Cyt-c表达的变化。结果：MTT结果显示小半夏加茯苓汤醇提物对BGC-823具有抑制作用，随着给药浓度的增加和作用时间的延长，抑制率逐渐升高，细胞活力逐渐减弱，与空白对照组比较有显著统计学差异（P001）。流式细胞术结果显示，与空白对照组相比，小半夏加茯苓汤醇提物能够显著降低线粒体跨膜电位（P001）；qRT-PCR结果显示，Bax基因表达显著升高（P001），Cyt-c基因表达升高（P005），Bcl-2基因的表达降低（P005）。结论：小半夏加茯苓汤醇提物可以抑制BGC-823细胞活力，诱导细胞凋亡并减小Bcl-2/Bax基因表达比例，增强Cyt-c基因表达，其机制可能与线粒体为核心的凋亡通路相关。 　　【关键词】小半夏加茯苓汤；胃癌细胞BGC-823；凋亡；线粒体； 　　【中图分类号】R2855【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2017）05-0042-04 　　胃癌作为常见的消化道系统肿瘤之一，其发病率和死亡率在中国排名第三[1]。胃癌的治疗方法包括手术、放疗、化疗，但放化疗引起的恶心、呕吐、食欲不振等消化道反应，如果未得到有效的控制，将降低胃癌患者的依从性及生存质量而放弃治疗。小半夏加茯苓汤（Xiao Banxia plus Fuling Decoction，XBFD）源于《金匮要略》，全方由半夏、生姜、茯苓组成，现代研究证实半夏、生姜、茯苓三味药均有不同程度的抗肿瘤作用[3-5]。具有散饮降逆、和胃止呕的作用，临床上对于化疗所致的迟发性呕吐症状有明显疗效，较甲氧氯普安疗效更好[2]。在辨证论治痰证肿瘤时亦常用到半夏、生姜、茯苓三味药，为了进一步明确小半夏加茯苓汤复方抗肿瘤的作用机理，本实验以胃癌细胞BGC-823为对象，运用流式细胞术、实时荧光定量PCR（Real Time PCR，RT-qPCR）等方法，检测线粒体跨膜电位（mitochondrialmembrane potential，MMP）以及相关基因表达的变化。 　　1材料与仪器 　　11材料与试剂人胃癌细胞BGC-823系购自上海细胞库。小半夏加茯苓汤醇提物（取生半夏18g，茯苓9g，生姜15g，50%乙醇于85℃水浴锅中提取，摇匀，干燥后称取15g小半夏加茯苓汤醇提物干粉，用50mL 50%乙醇溶解，得30mg/mL母液，稀释后使用[6]）、高糖DMEM培养基、胰蛋白酶、双抗、磷酸盐缓冲液均购自美国Hyclone公司、胎牛血清购自美国Gibco公司、四甲基偶氮唑蓝（MTT）、罗丹明123（Rhodamine 123，Rh123）均购自美国Sigma公司、Annexin V FITC/PI凋亡检测试剂盒购自美国BD公司、RNA提取试剂盒购自天根生化公司、Thermo ScientificMaxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix 购自 Thermo Scientific公司、引物由上海生工公司合成。 　　12主要仪器二氧化碳培养箱（Thermofisher，USA）、低温高速离心机（Beckman Coulter，USA）、多功能酶标仪（BioTek Synergy H4，USA）、流式细胞仪（BD，USA）、NanoDrop2000（Thermofisher，USA）、实时荧光定量PCR仪（ABI ViiA7TM Dx Fast，USA）。 　　2方法 　　21细胞培养和分组BGC-823细胞接种于含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的高糖DMEM培养液，置于37℃、5%CO2培养箱内常规培养。将细胞分为小半夏加茯苓汤醇提物组（800μg/mL、700μg/mL、600μg/mL、500μg/mL、400μg/mL），同时设不加药物的完全培养液为空白对照组和乙醇溶剂对照组。分别检测12、24h的实验结果。 　　22MTT 法检测细胞增殖抑制率取对数生长期的胃癌细胞BGC-823以6×104/孔接种于96孔板，预先设定调零组、空白对照组、乙醇溶剂对照组和给药组，给药组分别加入不同浓度的XBFD醇提物，乙醇溶剂对照组加入与800μg/mL实验组等量的50%乙醇，每个组至少设三个平行孔。分别培养12h、24h后，每孔加入200μl 含浓度为5mg/mL MTT的培养液，37℃孵育4h后，弃液后加入D