应用荧光微球检测禽流感病毒初步研究.docVIP

应用荧光微球检测禽流感病毒初步研究 　　摘 要：高分子荧光微球是一种性能良好的蛋白质载体，因可连接多种生物活性物质而便于多参数分析等，在生物医学领域被广泛使用。本研究将聚苯乙烯微球作为蛋白质载体，建立一种新的检测禽流感病毒的血清学方法。结果表明，微球与单克隆抗体、抗原、多克隆抗体和荧光二抗形成了双夹心的微球复合物，建立了禽流感病毒定量免疫诊断的基础。 　　关键词：禽流感病毒；荧光微球；检测 　　中图分类号：S852.64 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2015. 　　禽流感（Avian influenza，AI）是由甲型流感病毒引起的一种人畜共患的传染性疾病综合征。根据致病性的不同，禽流感可分为高致病性、低致病性和非致病性三级，是危害养殖业的最重要的疾病之一[1]。高致病性禽流感（High pathogenic avian influenza，HPAI）被世界动物卫生组织列为动物传染病中的A类疫病[2]，在世界范围内具有重要的防疫性和检疫性。禽流感病毒的实验室诊断方法主要有病毒的分离与鉴定、血清学诊断技术[3-5]、分子生物学诊断技术[6-9]、电镜技术等。新近发展起来的荧光微球因其材料不同而种类很多，由早期的聚苯乙烯微球，到后来出现的多种材料的高分子微球，如聚丙烯酸脂、二氧化硅、聚多糖类、聚丙烯酰胺、聚乙烯基吡啶等类型，其中聚苯乙烯微球目前仍被广泛应用[10-11]。以微球为载体，建立了基于荧光微球的流式细胞术检测方法。荧光微球稳定性好、粒度均一、单分散性好，其球形表面的弧度使抗体结合位点的暴露面与抗原决定簇处于最佳的反应状态，既使发光效率稳定高效又提高了反应的灵敏度，因而在生物医学、食品安全、分析化学以及某些高新技术领域都有着很重要的应用[12-13]。本研究是在高分子荧光微球、免疫荧光技术与流式细胞术等试验原理基础上建立的一种新型免疫学试验方法。 　　1 材料和方法 　　1.1 试 剂 　　红色荧光微球：（Spherotech，Inc）直径为4.0 μm，108个?mL-1；EDC[1-乙基-3-（3-二甲基胺丙基）-碳二亚胺]：购自美国SIGMA公司；NHS（N-羟基琥珀酸亚胺）：购自美国SIGMA公司；禽流感H5亚型单克隆抗体购自扬州大学；禽流感H5亚型基因工程表达抗原购自扬州大学；禽流感病毒多克隆抗体由本研究组自行研制；FITC标记的羊抗小鼠荧光抗体：购自SIGMA公司；FITC标记的羊抗兔荧光抗体：购自SIGMA公司；0.01 mol?L-1磷酸盐缓冲液（PBS）：pH=7.4；家兔：购自白求恩医大试验动物中心。 　　1.2 试验方法 　　1.2.1 兔抗禽流感抗体的制备及纯化 多克隆抗体制备的免疫方法采用背部多点注射法。选取两只成年公兔，注射禽流感H5亚型灭活疫苗每只1 mL。免疫3次后，测定抗体的效价。当抗体效价达到210以上时，心脏采血分离血清。将血清纯化、浓缩后测定蛋白含量至1 mg?mL-1以上，分装后置于4 ℃冰箱保存。 　　1.2.2 ELISA法确定抗体与抗原的匹配性 应用PBS缓冲液将单克隆抗体稀释成10，5.0，2.5，1.0 μg?mL-1后，于96孔ELISA酶标板纵行包被，放置在4 ℃冰箱过夜，洗涤后加入1%的封闭液BSA，恒温37 ℃封闭1 h，洗涤3次后加入1∶10稀释的禽流感H5亚型表达抗原，放置37 ℃1 h，取出后洗涤。酶标板中加入5 μg?mL-1的兔抗禽流感抗体，放置37 ℃ 1 h，洗涤后加入稀释的酶标羊抗兔IgG二抗，放置37 ℃1 h，洗涤后加入临时配制的底物溶液，显色反应15 min，于反应孔中加入2 mol?L-1硫酸终止反应。450 nm波长下测定OD值。阴性对照同时进行。以此确定单克隆抗体和多克隆抗体与抗原是否匹配。 　　1.2.3 单克隆抗体的固定 取1 μL直径为4.0 μm羧基荧光微球原液，加入EDC和NHS溶液活化30 min，用pH值7.4的PBS缓冲溶液离心洗涤已活化的微球，加入100 μL禽流感H5亚型单克隆抗体与微球连接，放置摇床于室温振荡2 h。充分离心洗涤后加入含有1%BSA的100 μL PBS溶液，室温振荡2 h后放置在4 ℃冰箱过夜，以此阻断微球表面的未反应位点。 　　1.2.4 微球双夹心法的流式测定 将连接了单克隆抗体的微球离心洗涤后置于100 μL的PBS溶液中。将一定量的禽流感阳性抗原加入，放置于室温振荡2 h。离心洗涤微球以去除未反应的阳性抗原。再加入一定量的禽流感多克隆抗体，放置于室温振荡2 h。将微球充分离心洗涤使未反应的抗体去除。最后加入一定量的FITC标记的羊抗兔荧光抗体，置摇床室温振荡2 h。离心洗涤3次，去除未反应的羊抗兔荧光抗体。重新将