猪链球菌对四环素耐药机制的分析及耐药基因三重pcr检测方法的建立-analysis of tetracycline resistance mechanism of streptococcus suis and establishment of triple pcr detection method for tetracycline resistance gene.docxVIP

山东农业大学硕士学位论文 山东农业大学硕士学位论文 猪链球菌对四环素耐药机制的研究及耐药基因三重 猪链球菌对四环素耐药机制的研究及耐药基因三重 PCR 检测方法的建立 PAGE PAGE 1 PAGE PAGE 2 中文摘要 猪链球菌病是由多种不同群的链球菌引起的猪不同临床诊断类型传染病的总称。可 致猪脑膜炎、关节炎、肺炎、心内膜炎、多发性浆膜炎和局部脓肿，同时该病还可导致 生猪从业人员感染和死亡，是一种重要的人畜共患病。随着抗生素在国内外养猪业中的 广泛应用，猪链球菌耐药性已相当严重，并呈现一定的区域特征。因此在具体治疗过程 中,应了解当地菌株的耐药特点,选择敏感性药物进行治疗,才能取得良好的治疗效果。 四环素作为治疗猪链球菌感染的主要有效药物，广泛用于畜牧养殖后，使得猪链球菌对 其耐药性日益严重，因此，本试验通过对四环素耐药性及耐药基因的研究，力求在分子 水平上为阐明猪链球菌对四环素的耐药机制提供依据。同时，通过对四环素耐药基因的 三重PCR检测方法的建立，使猪链球菌对四环素耐药性的实验室快速检测成为可能。本 试验主要从以下几个方面进行了研究： 1. 检测我国不同地区猪链球菌对常用抗生素的整体耐药情况。通过药敏试验检测了 1998年—2007年自我国不同地区分离鉴定的106株猪链球菌对10种临床常用抗生素头孢 吡肟、头孢曲松、红霉素、克拉霉素、四环素、万古霉素、左氧氟沙星、氧氟沙星、氯 霉素、克林霉素的耐药性情况。整体上看，所测菌株对四环素有普遍的耐药性，耐药率 达100 %；对于对头孢曲松、红霉素、克拉霉素、克林霉素有一定的耐药性，耐药率在 15 %~20 %之间；对头孢吡肟、万古霉素和氯霉素仍保存良好的敏感性。多重耐药率为 33 %，多重耐药现象主要以2耐为主（17株，16.1 %），主要耐药菌株及多重耐药的菌 株集中出现在江苏、四川和重庆。本试验为掌握我国大部分地区猪链球菌的耐药性情况 及临床提供有效药物治疗提供了依据。 2. 从分子水平上为研究猪链球菌对四环素的耐药机制提供依据。将耐药菌株对四环 素的最低抑菌浓度进行测定，并对四环素耐药基因 tet(M)、tet(O)、tet(K)、tet(L)、tet(Q)、 tet(S)、tet(T)和 tet(W)进行扩增和序列分析。试验结果表明，所测菌株 99%以上均为四 环素高度耐药菌株，我国大部分地区猪链球菌对四环素耐药现象严重；本试验检测的猪 链球菌对四环素的耐药基因为 tet(M)（80.2 %）、tet(O)（18.9 %）和 tet(L)（14.2 %），表 明我国的猪链球菌对四环素的耐药机制主要是由 tet(M)基因介导的核糖体保护作用；同 时本试验的检测结果显示，同为编码核糖体保护蛋白的 tet(M)、 tet(O)基因单独存在时， tet(M)基因的耐药程度高于 tet(O)基因；本试验所检测的 tet(M)、tet(O)基因与 GenBank 中我国不同地区的同种和不同种细菌的耐药基因具有高度的同源性（95 %~100 %, 95 %~99 %），表明 tet 基因在猪源与人源及其它动物源不同种属细菌间存在广泛的交换， 为猪链球菌对四环素耐药机制的研究奠定基础。 3. 成功建立了四环素常见耐药基因的三重PCR检测方法。通过对临床所测四环素耐 药基因tet(M)、tet(O)和tet(L)的序列进行分析比对，分别在其高度保守区设计3对特异性 引物，建立并优化了三重PCR检测耐药基因的方法。应用该方法检测15株猪链球菌对四 环素的耐药性，并与药敏试验结果进行比较，结果表明，该方法具有敏感、特异、重复 性好等优点，与药敏结果符合率达到100 %，建立了实验室快速准确检测猪链球菌对四 环素耐药性的方法。 关键词：猪链球菌；药敏试验；最低抑菌浓度；耐药基因；三重PCR Resistant Mechanism of Streptococcus suis to Tetracycline and Development of a Multiplex PCR for Resistant Gene Abstract The Streptococcicosis is the infectious disease of different types of clinical diagnosis which causes by many different groups of Streptococcus. Streptococcus suis could cause meningitis, arthritis, pneumonia, endocarditis, multiple serositis and local abscess and so on,