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苹果原生质体培养技术 　　摘要 介绍了苹果原生质体培养技术，主要包括材料选择、原生质体的分离、原生质体培养、原生质体再生植株培养等内容，以供参考。 　　关键词 苹果；原生质体；培养技术 　　中图分类号 S661.1；S188 文献标识码 B 文章编号 1007-5739（2016）13-0105-01 　　果树是世界上重要的经济作物，但因其生产周期长、占地面积大、受环境条件制约等原因，导致在传统的果树新品种选育以及苗木繁殖中，效率较低。植物组织培养以及基因工程技术的成熟与发展，为果树的苗木快繁和遗传改良开辟了一条高效的新途径。 　　果树属于蔷薇科苹果属，苹果是落叶果树中的主栽树种，也是世界上果树栽培面积较广、产量较广的树种之一。20世纪80年代以后，植物细胞工程和基因工程技术迅猛发展，使苹果新品种选育由个体水平逐步向细胞水平以及分子水平过渡，因植物细胞工程和基因工程和基因工程技术具有周期短、效率高、能充分利用远缘基因资源等优点，为苹果品种改良和苗木繁育开辟了一条高效的新途径[1]。苹果是多年生木本植物，成长周期长，高度杂合，采用传统的有性杂交进行新品种选育，周期长、效率低，且占用大量的土地资源。植物原生质体培养技术的发展为苹果的品种改良开辟了一条新途径[2]。 　　1 材料选择 　　1.1 基因型 　　不同基因型的原生体的分离难易程度、培养效果以及植株再分化能力有很大差别，试验中应多选一些品种进行筛选。迄今为止，从成功的实例看，实生杂交后代和砧木较栽培品种易获成功。 　　1.2 材料类型 　　分离苹果原生质体的材料有珠心愈伤组织、花药愈伤组织、悬浮细胞、茎尖、叶片、子叶。如果采用叶片来分离原生质体，则应选适度幼嫩的叶片，因为成熟叶片很难分离出原生质体。茎尖培养获得的试管苗的原生质体产率高且活力强。 　　1.3 材料生理状况 　　继代后悬浮系分离的原生质体及不同时期的愈伤组织的效果有很大差异，继代10～15 d比继代16～30 d的苹果花药愈伤组织分离得到的原生质体数量多、活力强。如果以愈伤组织或悬浮培养细胞为试材，应选取处于旺盛分裂期的细胞团，如果以器官或组织为试材，则应选择生长健壮植株上的外植体为试材[3]。 　　2 原生质体的分离 　　2.1 酶的种类和浓度 　　酶液的组成严重影响原生质体分离的效果，主要利用纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶。纤维素酶主要有Cellulase Onozuke RS、Cellulase Onozuke R-10；半纤维素酶主要有Hemicelluase、Rhozyme HP150；果胶酶主要有Maceozyme R-10、PectolyaseY23、Pectinase。如分离苹果悬浮细胞原生质体时使用的酶液组成是2% Cellulase Y23 OnozukaRS+0.1% Pectolyase Y23；分离苹果黄化茎尖和幼叶时为2% Cellulase RS+1% Hemicellulase+0.3% Pectinase。 　　2.2 原生质体分离与纯化 　　原生质体分离时要选择适宜的渗透压，以使细胞轻度质壁分离的浓度为宜。酶解处理时，材料与酶液的比例一般为1∶10（w/w）。酶解处理在25～28 ℃、低速振荡（30～50 r/min）、黑暗或弱光下进行。因供体材料以及酶液组成不同，酶解所需时间有很大差异。要注意酶液浓度不要过高，处理时间不要过长，酶解处理时间一般不宜超过12 h。酶解后收集纯化原生质体[4]。 　　2.3 其他因素 　　渗透压调节剂（渗透压调节剂可对脱去细胞的原生质体起到保护作用）一般采用甘露醇。在酶液中同时加入1% PVP，可有效抑制苹果原生质体的褐色；加入适量的PVP或2-（N-吗啡啉）乙磺酸[2-（N-morpholine）ethane sulfonic acid，MES]还能稳定酶解过程中的pH值；加入适量CaCl2具有保护质膜和提高原生质体稳定性的作用。 　　3 原生质体培养 　　3.1 培养方式 　　苹果原生质培养主要采取液体浅层培养，温度为（26±1）℃，散射光下静置培养，但浅层培养易使原生质聚集在一起。Huancaruna-Perales等将海藻酸钠应用于苹果原生质体琼脂糖包埋培养中，培养3 d细胞即开始第1次分裂。该培养方法便于原生质体的定点观察。在苹果原生质体培养中也采用了固―液双层培养的方式。 　　3.2 培养基种类及成分 　　苹果原生质体培养常采用MS、KM8p、D2等培养基。常用甘露醇与蔗糖或葡萄糖与蔗糖作为碳源。迄今研究表明，在培养基中加入复合有机成分有利于苹果砧木的原生质体培养。高浓度的NH4+对原生质体的生长发育不利，在许多报道中，用有机氮取代铵盐。M9和MM106的叶肉原生质体在以水解酪蛋白代替