基因工程学原理内蒙古大学70aluz9i.ppt

2）表达诱导 tac P Lac O S-D 插入位点区 rrnB T 宿主lac I IPTG 阻遏物 IPTG RNA 聚合酶 EcoRI SmaI BamHI SalI PstI HindIII PKK223-3 4586 bp ampr rrnB SD lacO tacP tetr ori EcoRI SmaI BamHI SalI PstI HindIII * 与细菌的分泌信号肽连在一起，可被宿主菌分泌到细胞周质中。 如：pIN III系列 2. 分泌型表达载体 pIN III-comA1, pIN III-comA2, pIN III-comA3, （1）组成结构 Ipp lac P lac O S-D/ATG ompa 插入位点 * Ipp（脂蛋白基因启动子）和lacUV5启动子。 ②调节基因：lac I ③S-D序列和ATG。 大肠杆菌外膜蛋白基因ompa。 ⑤插入位点区（多克隆位点）。 ① 强启动子： ④分泌信号肽： EcoRI , HindIII, BamHI pIN III-comA1 7.4 kp ampr IPP lacP lacO SD ompa ori lacI EcoRI HindIII BamHI * 外源基因产物蛋白与载体上的菌体蛋白连接在一起。 1）启动子：tac 2）操纵基因：lacP 3）调节基因：lacI 4）S-D序列 5）ori：pBR322 ori 6）GST(谷胱甘肽S转移酶） 3. 融合蛋白表达载体系统----pGEX系列 （1）优点 （2）组成结构 便于分离和纯化。 便于溶解 pGEX lacI tac lacP lacO SD GST ori ampr MCS * （3）产物分离 用Glutathione Sepharose亲和层析柱分离纯化，凝血酶或Xa因子把外源蛋白从GST上切下来。 column GST 凝血酶 可再利用 目的蛋白 洗脱 再利用 收集 * （4）几种pGEX的多克隆位点 1）pGEX-1?T EcoRI BamHI 凝血酶 Leu Val Pro Arg Gly Ser Pro Glu Phe Ile Val Thr Asp * CTG GTT CCG CGT GGA TCC CCG GAA TTC ATC GTG ACT GAC TGA CGA GST 2）pGEX-2X SmaI EcoRI BamHI 凝血酶 Leu Val Pro Arg Gly Ser Pro Gly Ile His Arg Asp * CTG GTT CCG CGT GGA TCC CCG GGA ATT CAT CGT GAC TGA CTGA CGA GST 3）pGEX-3X Ile Glu Gly Arg Gly Ile Pro Gly Asn Ser Ser * ATC GAA GGT CGT GGG ATC CCC GGG AAT TCA TCG TGA CTG ACT EcoRI BamHI SmaI Xa因子 * （5）其他融合蛋白系统 1）His-tag（组氨酸标签）： 在外源多肽的N端或C端接上6个组氨酸（His）。 His-tag能与Ni2+柱结合，但很容易被EDTA（或咪唑溶液）洗脱下来，可以纯化蛋白质。 如pET-his等。 * pET-his 2.9 kb ori PT7 SD Ampr ATG 6His ?CTG GTG CCG CGC GGA TCC GCA GAA TTC AGC GCT AGC TAA CAT CAT CAT CAT CAT TAA GCTT Leu Val Pro Arg BamHI EcoRI NheI HindIII thrombin切割位点 * 系列载体一般提供全部三种插入框： ??ZUV5载体: ??Z2载体: ??Z3载体: 缺乏蛋白质的加工（如糖基化、氨基酸修饰等）。 六、原核细胞表达的缺陷 * 人胰岛素在大肠杆菌中的表达 溴化氰 Cyanogen bromide： * 酵母菌、植物原生质体、动物培养细胞等。 第二节 外源基因在真核细胞中的表达 真核或病毒启动子 MCS PolyA信号 终止子 外源基因 * （1）有E.coli的复制起点 1. 酵母克隆载体的组件 一、在酵母中表达 Leu2+、His+、Ura3+、Trp1+; （5）有合适的克隆位点。 （4）有酵母的选择标记 Ori （3）有大肠杆菌的选择标记 Ampr、Tetr。 （2）有酵母的复制起点（可选） ARS * 由大肠杆菌质粒和酵母的选择标记构成。 YIp5： 2. 酵母的整合型载体(