绵羊肺腺瘤病的检测方法PCR方法-内蒙古自治区质量技术监督局.DOC

DB15/T DB15/T ××××—×××× PAGE II PAGE I 内蒙古自治区质量技术监督局 发布20xx-xx-xx实施20xx- 内蒙古自治区质量技术监督局 发布 20xx-xx-xx实施 20xx- xx-xx发布 绵羊肺腺瘤病的检测方法 PCR方法 Detection of ovine pulmonary adenomatosis PCR method （征求意见稿） DB15/T xxx—20xx DB15 内蒙古自治区地方标准 ICS X 04 备案号： DB15/T PAGE 1 前 言 本标准的附录A为资料性附录。 本标准由内蒙古出入境检验检疫局提出并负责解释。 本标准起草单位：内蒙古出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：王海艳、赵治国、敖威华、赵林立、郭铁筝、李刚、潘国卿。 PAGE 3 绵羊肺腺瘤病的检测方法 PCR方法 范围 本标准规定了绵羊肺腺瘤病的检测方法。 本标准适用于血液及支气管肺泡样品中绵羊肺腺瘤病的定性检测。 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 6682 分析实验室用水规格和试验方法（eqv ISO 3696:1987） GB/T 19495.2 转基因产品检测 实验室技术要求 3 术语和定义 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）；PCR 用于扩增位于量算已知序列之间DNA（deoxyribonucleosidea acid，脱氧核糖核酸）的方法。模板DNA经过高温变性成单链，在DNA聚合酶和适宜的温度下，两条互不互补的寡核苷酸片段即引物分别于模板DNA两条链上的一段互补序列发生退火，接着在DNA聚合酶的催化下以4种dNTP(deoxyribonucleoside triphosphate，脱氧核苷酸三磷酸)为底物，使退火引物得以延伸，如此反复变性、退火和DNA合成这一循环，使位于两段已知序列之间的DNA片段呈几何倍数扩增，经25个~30个扩增循环，扩增倍数达到106。 4检测过程中防止交叉污染的措施 绵羊肺腺瘤病PCR定性检测过程中防止交叉污染的措施按照GB/T 19495.2要求执行。 5原理 提取绵羊肺腺瘤病毒DNA，以提取的DNA为模板进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。 6试剂和材料 除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂，实验用水符合GB 6682的要求。 6.1 绵羊肺腺瘤病检测引物（对）序列为： Por F：5’-TGGGAGCTCTTTGGCAAAAGCC Por R：5’-CACCGGATTTTTACACAATCACCGG 6.2 盐酸氯胺酮。 6.3 2 %氨苯异丁酯。 6.4 生理盐水：称取9 g NaCl，溶于1000 mL蒸馏水中，121 6.5 Dneasy tissue kit (Qiagen,Hilden,Genmany)。 6.6 Taq DNA聚合酶（Taq，Thermus aquaticu，水生栖热菌）。 6.7 dNTPs：dATP(deoxyadenosine triphosphate，脱氧腺苷三磷酸)、dTTP (deoxythymidine triphosphate，脱氧胸腺三磷酸)、dCTP（deoxycytidine triphosphate，脱氧胞苷三磷酸）、dGTP（deoxyguanosine triphosphate，脱氧鸟苷三磷酸）。 6.8 琼脂糖：电泳纯。 6.9 溴化乙锭。 6.10 分子量标准品（100 bp-2000 bp）（bp：base pair，碱基对）。 6.11 TE缓冲液。 6.12 10×PCR缓冲液。 6.13 电泳缓冲液：Tris 54 g，硼酸27.5 g，0.5 mol/L TE缓冲液（pH 8.0）20 mL,加蒸馏水至1000 mL；使用时10倍稀释。 6.14 溴化乙锭贮存液：用水配制成10 mg/mL。 6.15 加样缓冲液：0.2 5%溴酚蓝，质量浓度为40 %的蔗糖水溶液。配制方法：称取溴酚蓝0.125 g，加双蒸水5 mL，室温下过夜，待其溶解后，称取蔗糖20 g加入到溴酚蓝溶液中，摇匀定容至50 mL，加入一滴氢氧化钠溶液，调至蓝色。 7仪器设备 7.1 PCR仪。 7.2 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。 7.3 恒温水浴锅。 7.4 离心机：离心力20000 g。 7.5 微量移液器。 7.6 电泳仪。 7.7 凝胶成像系统。 7.8 pH计。 7.9 天平：感量0.01。 8 样品采集 血液样品：无菌采取