肿瘤肽特异性的同种cd4t细胞的诱导及其对荷瘤裸鼠抗瘤作用的分析-induction of tumor peptide-specific cd4t cells and its anti-tumor effect on tumor-bearing nude mice.docx

华 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 PAGE 3 PAGE 3 肿瘤肽特异性的同种 CD4+ T 细胞的诱导 及其对荷瘤裸鼠抗瘤作用的研究 博士研究生 ：宋银宏 指导教师 ：吴雄文 教授 中文摘要 T 细胞在同种移植物排斥反应和移植物抗宿主病中起主要作用，CD4+和 CD8+ T 细胞都参与了这些反应。T 细胞 TCR 识别的配体是抗原肽和 MHC I 或 MHC II 分子 形成的复合物（pMHC），分别被 CD8+和 CD4+ T 细胞识别。急性排斥反应中 T 细胞 对同种抗原的直接识别起主要作用。研究表明 T 细胞识别抗原肽/同种 MHC 复合物和 抗原肽/自身 MHC 复合物一样通常也是 pMHC 特异性的，并且 TCR 和同种 MHC 分 子的相互作用方式与传统的自身 MHC 分子提呈抗原肽给 TCR 识别是一样的。抗原肽 特异性的的同种反应性 T 细胞被称为同种限制性 T 细胞。已有研究证实是 CD4+而非 CD8+ T 细胞在同种排斥反应中起本质作用：一方面 CD4+ T 可以辅助其他淋巴细胞参 加免疫反应，另一方面它本身也是移植物排斥反应的效应细胞。同时，临床资料显示 移植物抗白血病反应 (GVLR) 使白血病病人的病情得以缓解，并且移植物抗肿瘤反 应 (GVTR) 在许多实体瘤的病例中也得到证实，这是由于供者 T 淋巴细胞对宿主的 白血病细胞及肿瘤细胞发生了免疫反应。尽管许多研究都集中于 CD8+ T 细胞在 GVLR 或者 GVTR 中的作用并且发现 CD8+ T 细胞在其中发挥效应作用，但实际上在 GVLR 中需要 CD4+ T 和 CD8+ T 细胞两者共同参与。由于 CD4+ T 细胞在普通免疫反应和同 种反应中均发挥重要作用，我们认为同种反应性 CD4+ T 细胞尤其是同种限制性 CD4+ T 细胞可能在 GVLR 或者 GVTR 中起重要作用。本研究目的是要建立一个诱生同种限 制性 CD4+ T 细胞的方法并且观察这种 CD4+ T 细胞的肿瘤排斥效应。 本研究先制备出肿瘤抗原肽/HLA-DR15/IgG1-Fc 二聚体，再将结合了此二聚体的 HLA-DR15 阴性的单核细胞和自体的外周血淋巴细胞（PBL）共培养诱导出肿瘤肽特 异性的同种 CD4+ T 细胞，并将此细胞过继到荷瘤裸鼠体内，发现其可以明显抑制荷 瘤裸鼠体内的肿瘤生长，延长其生存期。论文共分为三部分，其主要内容与结果如下： 一、制备HLA-DR15/IgG1-Fc二聚体，并且该二聚体能有效结合到HLA-DR15 阴性（DR15-ve）个体的单核细胞表面 采用RT-PCR方法从人宫颈癌细胞系SiHa (为HLA-DR15基因型) 中扩增DRα链和 DRβ链的信号肽及胞外序列以及转录因子Fos和Jun 的亮氨酸拉链序列，将扩增的DRα 段和DRβ段分别和转录因子Fos和Jun 的亮氨酸拉链区连接形成DRα-Fos和DRβ-Jun，再 将DRα-Fos和人IgG1的Fc段相连，构建出重组载体pFastBacT MDual+[DR15/IgG1-Fc]。 将此载体转化大肠杆菌DH10BacT M，得到重组的穿梭质粒Bacmid+[DR15/IgG1-Fc]， 将此穿梭质粒转入昆虫细胞Sf9中，收获上清得到成熟病毒颗粒，再用此病毒颗粒大 量感染Sf9细胞，收集病毒感染的Sf9细胞培养上清, 通过葡萄球菌蛋白A（SPA）柱纯 化 得 到 可 溶 性 DR15/IgG1-Fc 二 聚 体 融 合 蛋 白 （ 简 称 DR15 二 聚 体 ）。 ELISA 和 Western-blotting检测均证实DR15二聚体产物由两部分组成：二聚化的DR15的胞外段 提供有效的TCR反应部分，IgG1-Fc段能与单核细胞表面高亲和力受体FcγRI结合。 将纯化的DR15二聚体与DR15-ve个体的单核细胞孵育，用流式细胞术检测具有 HLA-DR15阳性表型的单核细胞百分数以确定二聚体与DR15-ve单核细胞的结合能 力。流式分析结果显示DR15-ve单核细胞结合DR15二聚体后大多数具有HLA-DR15 阳性表型，说明DR15二聚体可以有效结合到DR15-ve单核细胞表面。 二、结合了抗原肽/HLA-DR15/IgG1-Fc 二聚体的单核细胞诱导肽特异性的同种 CD4+ T 细胞的产生 为诱导抗原肽特异性的同种 CD4+ T 细胞，本研究建立了一个共培养体系：纯化的 DR15 二聚体加载其限制性肽后结合到酸洗过的 DR15-ve 个体的单核细胞表面，形成 共培养体系中的刺激细胞；同一个体来源的外周血 淋巴细胞 (PBLs) 作为共培养体系 中的效应细胞。共培养 7 d 后，通