肿瘤抗原cml28hla-a0201限制性ctl表位的鉴定-identification of tumor antigen cml 28 hla - a 0201 restricted ctl epitope.docxVIP

第三军医大学硕士学位论文 第三军医大学硕士学位论文 6 6 肿瘤抗原 CML28 HLA-A*0201 限制性 CTL 表位体外及体内 鉴定 摘要 肿瘤是目前影响人类健康的重要疾病之一 手术切除 放射治疗 化学药物治疗 或以上几种方法的联合应用是临床上治疗肿瘤的几种主要方法 但是以上几种方法在 对某些肿瘤 特别是对晚期恶性肿瘤的治疗上 还没有取得令人满意的效果 近年来 通过分析肿瘤患者体内自发性的针对自身肿瘤的免疫反应 已经鉴定出一系列的肿瘤 相关抗原 这些肿瘤能够被肿瘤细胞加工 处理并以 MHC--肽复合物的形式被呈递 到细胞表面 被特异性的 CTL 细胞所识别 导致肿瘤细胞的溶解 引发以这些肿瘤抗 原为靶标的抗肿瘤免疫 因此 以肿瘤抗原作为靶标 进行肿瘤特异性的免疫治疗 成为当今研究的热点 有望成为除放疗 化疗 手术治疗等常规治疗手段外的治疗肿 瘤 特别是恶性肿瘤的 第四种 手段 在这些种类繁多的肿瘤相关抗原中 癌胚抗 原CT 抗原引起自身特性 是对肿瘤进行免疫治疗的最理想的靶标 CT 抗原是一类特殊的肿瘤相关抗原 它们广泛地表达于多种组织来源的恶性肿 瘤组织中 除在睾丸和胎盘组织中有所表达外 其他正常组织中均不能检测到该类抗 原的表达 而且该类抗原免疫原性强 能够激发特异性的细胞及体液免疫反应 因此 CT 抗原无疑是肿瘤免疫治疗的理想靶标 迄今为止 实验已经证实 来源于多种 CT 抗原如 MAGE-1, MAGE-3 and NY-ESO-1的抗原肽能够在体外有效地激发 MHC I 分子限制性的 CTL 反应 进一步的临床实验表明 用 CT 抗原来源的 CTL 表位肽负 载到 DC 细胞上 作为临床上恶性黑色素瘤和其他恶性肿瘤疾病的一种治疗手段 已 经取得了一定的治疗效果 提示以 CT 抗原的 CTL 表位为基础的肽疫苗是临床对恶性 肿瘤进行免疫治疗的一种行之有效的方法 但是 CT 抗原的表达具有异质性 在不 PAGE PAGE 7 同患者之间 不同组织来源的肿瘤组织间表达具有差异 而且在同一患者同一类型肿 瘤发展的不同时期的表达也有明显的差异 因此 鉴定尽可能多 CT 抗原的 CTL 表位 对于临床上恶性肿瘤的免疫学治疗具有重要的意义 慢性白血病肿瘤抗原 CML28 是由 Xiao-Feng Yang 等利用 SEREXcDNA 表达文 库血清分析方法鉴定的一种新的 CT 抗原 研究证实 该肿瘤抗原不仅在慢性白血 病等血液系统恶性肿瘤中高表达 而且在多种上皮来源的实体肿瘤中也有高水平的表 达 而在睾丸外的正常组织中则未检测到表达 鉴于 HLA-A*0201 是中国人群中最为 常见的 HLA类分子的型别 阳性率高达 50% 而且也是北美高加索人种中最常见的 HLA类分子的型别 其阳性率高达 98% 因此 如果肿瘤抗原 CML28 的 HLA-A*0201 限制的 CTL 表位被鉴定 将会对于中国人群中和北美高加索人群中 CML28 表达阳性的 肿瘤的免疫治疗 具有十分重要的作用 在本实验中 我们致力于鉴定 CML28 的 HLA-A*0201 限制性 CTL 表位 首先 我们采用超基序和量化基序相结合对慢性白血病肿瘤抗原 CML28 的 HLA-A2 限制性 表位进行预测 先采用超基序法对所有可能成为 CML28 抗原的 HLA-A2 型 CTL 表位 的九肽筛选 发现符合条件的九肽序列共有 45 条 然后利用量化基序对每个位点的结 合力进行量化 应用九肽结合矩阵对 45 个表位进行计算和排序 发现符合条件的肽共 有 15 条 我们从中选出亲和力最高的四条肽 ALFCGVACAiALVDAGVPM ALDSDGTLV SLLACCLNA合成纯化鉴定 其次 采用表达 HLA-A2 分子的 T2 检测候选肽与 HLA-A2 分子的结合情况 候选肽 ALVDAGVPM 和 ALDSDGTLV 的亲 和力较高 FI 值分别是 1.17 1.17 ALFCGVACA 和 SLLACCLNA 仅有低度亲和力 FI 值分别是 0.49 0.96 最后 采用灵敏度高的 ELISPOT 和 51Cr 释放法检测抗原 肽体外刺激 HLA-A2 阳性的健康人 PBMC 所产生的抗原肽特异性的 T 细胞分泌的细胞 因子和溶解活性 结果显示 ALVDAGVPM173-181刺激 PBMC 所产生的 T 细胞能 特异性的杀伤 HLA-A2 和 CML28 表达阳性的肿瘤细胞 LB373-MEL 并分泌较高水平 的 IFN- 为了进一步证实该表位能在体内能够被自然地被加工处理并被呈递 与 T 细胞相互作用 诱发特异性的 CTL 产生 我们用 CML28 表达质粒 PCI/