中国水仙遗传转化体系分析及ntleafy基因在花芽分化过程中的表达-analysis of genetic transformation system of narcissus tazetta and expression of ntleafy gene in flower bud differentiation.docx

万方数据 万方数据 Dissertation for the Degree Study on Agrobacterium-mediated Transformation of Narci ssus tazetta var. chinensis and NTLEAFY gene expression during the flower differentiation Candidate: Zhang Xiaoqing Supervisor: Prof. Peng Zhenhua Academic Degree Applied for: Ph. D Gardening Plants and Ornamental Hort Speciality:  iculture Date of Defence : June，2012 Degree-Conferring-Institution: Chinese Academy of Forestry 独 创 性 声 明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或 撰写过的研究成果，也不包含为获得本研究生培养单位或其它教育机构的学位或证书而使 用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明 并表示谢意。 学位论文作者签名： 日期： 年 月 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解中国林业科学研究院有关保留、使用学位论文的规定，中国 林业科学研究院有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被 查阅和借阅。本人授权中国林业科学研究院可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数 据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 （保密的学位论文在解密后适用本授权书） 学位论文作者签名： 导师签名： 年 月 日 年 月 日 学位论文作者毕业联系方式 工作单位： 联系电话： 电子邮件： 通讯地址、邮编： 摘 要 中国水仙（Narcissus tazetta var．chinensis）是我国十大传统名花之一，栽植历史悠 久。但由于其为三倍体植株，不结实，传统的杂交育种无法进行，千年来只有‘金盏银 台’，‘玉玲珑’等少数几个品种，限制了中国水仙产业的发展。随着生物技术的不断成 熟，特别是基因工程技术的发展为中国水仙的品种创新提供了有效途径。建立有效的遗 传转化体系、发掘中国水仙中潜在的基因资源是中国水仙基因工程育种的必要前提。 通过对中国水仙‘金盏银台’品种的各花器官愈伤组织的诱导，筛选出花梗为最佳 外植体。其优点有：灭菌方法简便；无愈伤组织诱导、继代难的问题；鳞茎芽再生时间 短。筛选出花梗愈伤组织诱导及鳞茎芽分化的最佳培养基为 MS + 1 g·L-1 NaH2PO4 + 0.003 g·L-1 6-BA + 0.001 g·L-1 NAA + 0.2 g·L-1 Ad + 30 g·L-1 sucrose。愈伤诱导率达 43.33%，愈伤组织诱导到鳞茎芽分化的时间一共需要 30～35 d，比其它组织通过愈伤组 织途径诱导芽再生时间缩短约 50 d。组织学观察表明小鳞茎是由愈伤组织再分化得来的。 通过对几种不同农杆菌菌株侵染率的比较，选择菌株 LBA4404；侵染时 100 mg·L-1 的乙酰丁香酮对农杆菌具有较好的活化作用；最佳预培养时间为 15 d；最佳共培养时间 为 3 d；最佳抑菌抗生素为头孢霉素，浓度控制在 400 mg·L-1。GUS 染色结果显示农杆菌 LBA4404 转化花梗外植体得到了阳性的鳞茎芽。利用该方法进行 NTLEAFY 基因的转化， PCR 检测及 Southern 杂交检测证明得到转 NTLEAFY 基因已经整合到中国水仙基因组中。 LEAFY 基因是成花相关基因，与中国水仙的花芽分化相关。切片观察表明从 7 月上 旬开始，经叶芽时期、花序原基形成期、佛焰状总苞形成期、花原基形成期、花被片形 成期、雄蕊形成期、雌蕊形成期 7 个时期，到 9 月中旬形成雌蕊结束。分别取中国水仙 花芽分化各阶段的组织，用 qRT-PCR 方法进行 NTLEAFY 的表达模式分析，主花序中表 达量在花芽分化中、后期比花芽分化初始期高，主花序中第一朵小花花冠形成期，基因 相对表达量最高。鳞片中的表达量随着花芽分化过程逐渐降低。NTLEAFY 基因的表达在 花芽中高于鳞片中。证明该基因在中国水仙中调控花芽的启动并参与整个花发育过程。 关键词：中国水仙、愈伤组织、遗传转化、花芽分化、NTLEAFY 基因 I Abstract Narcissus tazetta var. ch