普通小麦5DL染色体分选及染色体BIBAC文库构建-中国农业科学.PDFVIP

中国农业科学 2008,41(2):354-361 Scientia Agricultura Sinica 普通小麦5DL染色体分选及染色体BIBAC文库 构建技术体系优化 1,2 3 1 1 1 2 1 佘茂云 ，郭东伟 ，李连城 ，徐兆师 ，陈 明 ，曲延英 ，马有志 1 （中国农业科学院作物科学研究所/ 国家农作物基因资源与基因改良重大科学工程/农业部作物遗传育种重点开放实验室，北京 100081 ； 2 3 新疆农业大学农学院，乌鲁木齐 830052 ； 西北农林科技大学农学院，陕西杨凌 712100 ） 摘要：【目的】优化小麦染色体流式分选及特定染色体 BAC 文库构建技术体系，为加速小麦基因组学研究提 供技术支撑。【方法】采用双阻断法对中国春 5DL 端体根尖分生组织进行细胞周期同步化处理，结合机械匀浆法 制备染色体悬浮液进行流式核型分析，分选染色体 5DL 及 PCR 检测，对小麦染色体分选技术体系进行优化。对复 合峰分选产物 Bam HI 酶切制备高分子量（high molecular weight，HMW）DNA，按 10 ﹕1 质量比与双元细菌人工 染色体（binary-bacterial artificial chromosome，BIBAC）连接，电激转化感受态细胞 DH10B，随机挑取 100 个重组子，经 NotI完全酶切后脉冲电泳检测插入片段大小，优化小麦染色体BAC文库构建的技术体系。【结果】 经1.25 mmol·L-1 -1 羟基脲（hydroxyurea，HU）18 h，恢复6 h和1 µmol·L 氟乐灵（trifluralin）2.5 h 的顺序 处理的小麦根尖分生组织，细胞有丝分裂指数可超过60%。流式核型分析表明，5DL端体的流式核型图由清晰的三 个复合峰和两个单峰组成。PCR鉴定表明，其中一单峰确由5DL染色体组成。部分酶切复合峰染色体3～10 min， 可以获得50～300 kb 的HMW DNA。连接产物检测显示平均插入片段可达100 kb左右，根据荧光通道值，估算5DL 端体的大小约为 482 Mb，构建库容为 19 000 个克隆的 5DL 端体特异文库即可达到约 4 倍的覆盖率。【结论】上 述两项优化技术适用于小麦染色体的分选及染色体特异文库的构建。 关键词：普通小麦；端体；细胞周期同步化；流式细胞术；染色体分选 Optimizing Protocol of Flow Sorting Chromosome 5DL (Triticum aestivum L.) and Chromosome-specific BIBAC Library Construction 1,2 3 1 1 1 2 1 SHE Mao-yun , GUO Dong-wei , LI Lian-cheng , XU Zhao-shi , CHEN Ming , QU Yan-ying , MA You-zhi 1 ( Institute of Crop Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences / The National Key Facility for Crop Gene Resources and Genetic Improvement, NFCRI / K