放线菌C311抗菌活性筛选及发酵液稳定性研究.docVIP

放线菌C311抗菌活性筛选及发酵液稳定性研究 　　摘要从重庆酉阳山区土样中分离到1株放线菌C3-11，该菌株发酵液对14种病原真菌进行室内生物活性筛选，结果表明，C3-11菌株发酵液对油菜菌核病菌和黄瓜灰霉病菌的菌丝抑制率都在90%以上，对其余供试病原菌均有不同的抑制作用。通过对发酵液稳定性的初步研究，表明该菌株的发酵液对光照、温度及酸性条件作用下都较为稳定。 　　关键词放线菌C3-11；抗菌活性；稳定性 　　中图分类号Q939.96文献标识码A文章编号 1007-5739（2009）03-0109-02 　　 　　从微生物代谢产物中寻找控制有害生物的生物农药是新农药研究的一个重要方向[1]，放线菌是重要的微生物资源，是产生抗生素的主要来源。目前从微生物中发现的大约8 000种生物活性物质中，近70%是由放线菌产生的[2-5]，世界各国对放线菌的研究与资源开发极为重视，其中农用抗生素的筛选和应用已成为研究的重点。因此，从放线菌中寻找农用抗活性物质有较为广阔的前景。本研究是从我国不同地域采集的土样中，进行广泛地筛选分离，从重庆酉阳山区的土样中分离到1株放线菌C3-11，该菌株对油菜菌核病菌有强烈的抑制作用，同时对其他病菌也有一定的抑制作用，在确定其生物活性后，又对其发酵液的稳定性做了进一步的研究，现总结如下。 　　 　　1材料与方法 　　 　　1.1材料 　　1.1.1供试土样。试验所用土样采自于重庆、河南、云南和贵州等地。 　　1.1.2供试病原菌。油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）、黄瓜灰霉病菌（Botrytis cinerea）、小麦赤霉病菌（Gibberella zeae）、苹果腐烂病菌（Cytospora mandshurica）、辣椒枯萎病菌（Fusarium oxysporium）、马铃薯晚疫病菌（Phytophthora infestans）、半夏立枯病原菌（Rhizoctonia solani）、水稻纹枯病原菌（Thanatephorus cucumeris）、烟灰霉病菌（Botrytis cinerea）、玉米小斑病菌（Bipolaris maydis）、玉米大斑病菌（Exserohilum turcicum）、交链孢病菌（Al-ternaria alternata）、莴苣黑斑病菌（Stemphylium chisha）、甘薯?\疤病菌（Ceratocystis fimbriata）、大肠杆菌（Escherichia coli）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtills）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）。 　　1.1.3培养基。PDA培养基，牛肉膏蛋白胨培养基；高氏1号合成培养基（可溶性淀粉20g，KH2PO4 0.5g，MgSO4?7H2O 0.5g，KNO3 1g，NaCl 0.5g，FeSO4 0.01g，琼脂20.0g，水1 000mL，pH值7.6~7.8）；液体发酵培养液（1%小米浸出汁1 000mL，葡萄糖10.0g，蛋白胨3.0g，NaCl 2.5g，CaCO3 2.0g，pH值7.2～7.4。用250mL三角瓶分装，每瓶100mL，121°C灭菌30 min。）；种子发酵培养基（1%小米浸出汁1 000mL，葡萄糖10.0g，淀粉20.0g，酵母膏5.0g，蛋白胨5.0g，牛肉膏3.0g，CaCO3 2.0g，pH值7.2～7.4）。 　　1.2方法 　　1.2.1菌种的筛选。将土样自然风干，用研钵磨细，过孔径0.1mm筛，称取研细的土壤5g，加入盛有45mL灭菌水的三角瓶中，充分振荡，制成10-1土壤浓度悬浮液。待土粒沉淀后，吸取1.0mL上清液，移入盛有9mL灭菌水的10mL容量瓶中，制成10-2土壤浓度悬浮液。依此类推，制成10-3、10-4和10-5土壤浓度悬浮液，吸取上述10-3～10-5土壤浓度悬浮液0.1mL（约2滴），加到高氏1号合成琼脂培养基平板上（加50mg/L重铬酸钾作为抑制剂）进行菌种分离，用灭菌涂布棒涂均。28℃培养，纯化后转接到斜面保存。 　　1.2.2发酵液的制备。将保存的菌种划线接种于高氏1号平面培养基上，置于28℃恒温培养箱培养6d。将培养好的菌落接入种子发酵培养基中置于恒温摇床上发酵2d，将种子发酵液以10%的接种量接种于小米液体发酵培养基中，28℃发酵6d后过滤，发酵液4℃冰箱中保存备用。 　　1.2.3抑菌试验。 　　（1）菌丝生长速率法[6]。将原始菌株发酵液10mL与90mL融化的PDA培养基混匀，倒入无菌培养皿中制成带药培养基平板。培养基凝固后，在每个培养基平板上放入1个供试病原真菌菌饼（直径为4mm），使菌饼带菌丝的一面贴在培养基表面，每处理