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外科学专业毕业论文 [精品论文] RNA干扰技术特异性抑制肾癌survivin表达的体外实验研究 关键词：肾癌 RNA干扰 survivin基因 基因表达 基因治疗 摘要：RNA干扰（RNA interfering，RNAi）是近年发展起来的一种基因沉默技术，已成为对目的基因的功能、抗病毒和抗肿瘤基因治疗方面研究的热点；与其他肿瘤基因治疗技术一样，RNAi在应用过程中同样存在靶向性的问题。凋亡抑制基因Survivin是IAP家族的一个新成员，广泛表达于多种肿瘤组织，而在正常组织及癌旁组织中无表达或低表达。Survivin除具有抑制细胞凋亡、调节细胞有丝分裂的功能外，还参与肿瘤血管生成、引起肿瘤细胞对放疗及化疗的耐药性等。发现至今，Survivin已成为肿瘤基因治疗理想的靶点和热点。 肾癌是泌尿系统常见的恶性肿瘤之一，发病率及恶性程度高。其早期无症状，出现症状后约30％患者已到晚期，就诊时已发生转移，手术效果差或丧失了手术机会；对放射治疗、化学治疗和激素治疗不敏感，其5年生存率不足10％，所以迫切需要寻求新的治疗手段提高疗效。近年来有研究表明Survivin在肾癌中高表达。 本实验在证实人肾癌786-O高表达Survivin的基础上，利用RNAi技术，使用载体pGenesil-1构建的重组质粒shRNA-Survivin，以脂质体转染入高表达Survivin的人肾癌786-0细胞株，显著抑制了SurvivinSurvivin mRNA的转录和蛋白表达，并抑制了细胞的活性，从体外细胞水平为以Survivin为靶基因的RNAi治疗肾癌提供可靠的实验室依据。 目的： 第一部分：检测人肾癌786-O细胞株中的Survivin基因表达水平，探讨Survivin基因在人肾癌786-O细胞株中表达的意义。第二部分：设计针对survivin基因的siRNA并与质粒载体连接，转化大肠杆菌，挑选抗性菌落扩增培养重组质粒。第三部分：根据Survivin基因高表达于肾癌以及shRNA-Survivin抑制786-O细胞内Survlvm基因表达的特点，将shRNA-Survivin及对照质粒pGenesil-1转染至786-O后，了解RNA干扰Survivin基因后对786-O活性的影响，并检测转染后786-O细胞中的Survivin mRNA及蛋白表达水平。 方法： 第一部分：1.培养人肾癌786-O细胞株并用MTT法绘制生长曲线；2.RT-PCR检测Survivin mRNA在786-O细胞内的转录水平；3.Western-blot检测Survivin基因蛋白质的表达水平。第二部分：1.根据survlvin基因在GeneBank中序列设计相应的三组阳性siRNA和一组阴性对照，其转录模板与pGenesil-1连接并转化入大肠杆菌DH5α菌株；2.挑选卡那霉素抗性菌落并扩增培养；3.提取各组卡那抗性菌落的质粒。第三部分：1.重组质粒pGenesil-1-survivinl、pGenesil-1-survivin2、pGenesil-3、阴性对照质粒HK以脂质体转染至786-O；2.观察转染后各组细胞形态及转染率，采用MTT法绘制转染后各组及脂质体组细胞生长曲线；3.RT-PCR检测Survivin mRNA在各组的转录水平；4.Western-blot检测Survivin蛋白在各组的表达水平。 结果： 第一部分：1.肾癌786-O细胞株经培养其倍增时间为52.22h，与文献报道相符；2.RT-PCR显示786-O中有Survivin mRNA的表达；3.Western-blot显示786-O中有Survivin基因蛋白质的表达。第二部分：成功得到三组阳性siRNA（survivin1 GGACCACCGCATCTCTACA166；survivin2 GCATTCGTCCGGTTGCGCT358：survivin3GGCTGGCTTCATCCACTGC241）和一组阴性对照（GACTTCATAAGGCGCATGC）。Survivin基因有三个亚型，其中除了survivin2不能与variant2（NM001012270）匹配，只能与variant1（NM001168）、variant3（NM001012271）匹配外，survivin1和survivin3均可与survivin的3个亚型匹配。第三部分：1.转染24h后，各组细胞形态相似，荧光显微镜下ABCD组可见少量绿色荧光。54h，各组部分细胞变圆，折光性降低，有较多坏死细胞，尤以A、C严重，荧光下A、B、C、D组绿色荧光较前明显增多。转染率的计算，转染各组约为35％，单纯脂质体组为0；2.RT-PCR显示S1组和S3组中SUrvivin mRNA的表达下调；3.W