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核桃RAPD扩增产物不同电泳检测及其序列特点 　　摘要：1.3％琼脂糖凝胶和5％聚丙烯酰胺凝胶电泳对核桃RAPD扩增产物检测的结果表明。5％聚丙烯酰胺凝胶对RAPD扩增产物的分离效果较1.3％琼脂糖凝胶好。根据两者的电泳结果构建了树状聚类图，聚类结果大致相同，两种电泳方法都能正确地反映出品种间的遗传关系。通过挑选20个片段进行克隆，发现20条序列都来自核桃基因组。其中，编码蛋白基因的序列为5条，占所克隆片段的25％。 　　关键词：核桃；RAPD；琼脂糖凝胶电泳；聚丙烯酰胺凝胶电泳；序列特点 　　中图分类号：Q503　文献标识号：A　文章编号：1001-4942(2010)10-0001-06 　　 　　核桃(Juglans regia L)属于胡桃科核桃属，是我国栽培历史悠久、分布广泛的重要速生林业用材和可食性坚果树种，其种仁除含脂肪、蛋白质、碳水化合物外，还含钙、磷、铁、胡萝卜素、硫胺素、核黄索和尼克酸等多种成分，具有很高的营养价值、药用价值和经济价值，有“21世纪超级食品”的美誉。我国是核桃属的分布中心区，也是核桃的原产地，核桃种质资源丰富，品种繁多，共记载品种有860多种，具有重要的生物学意义和经济价值。核桃种质资源遗传多样性研究是核桃种质资源学研究的重要内容和核桃新品种选育的理论基础。利用分子标记技术对核桃资源进行遗传多样性分析，可为资源的保护和利用提供可靠有效的理论依据，还可以搞清楚核桃种质资源内的物种关系，为核桃遗传育种及遗传规律的研究奠定基础。另外，与其它大多数林木树种相比，核桃通常作为果树进行栽培，生产中对其品种纯度的要求和果树一样高，理论上。相同品种的遗传背景完全一致，因此核桃品种的鉴定对于苗木纯度分析以及品种产权保护具有重要意义。建立简便、快速、高效的核桃品种鉴定的技术体系具有必要性。 　　RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA)，即随机扩增多态性DNA，是分子标记的一种，具有模板DNA量少(15-25ng)、无或少污染、费用较低、实验设备相对简单、技术简便等优点，且无需预先了解DNA模板的序列，在对遗传背景所知甚少的物种遗传分析方面具有特殊优势。目前已经有RAPD用于核桃遗传多样性分析方面的文章报道，但是对于RAPD扩增产物的继续深入分析，除了转化为SCAR标记外，对于其性质目前还缺乏充分的认识。而聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel，PAG)电泳比琼脂糖凝胶电泳具有上样量少、分辨率高、显示信息完全等优点，有利于扩增产物的后续分析。迄今，将聚丙烯酰胺凝胶电泳应用于核桃RAPD中的研究还未见报道。本研究建立在已有的核桃RAPD反应体系的基础上，利用16份重要的核桃品种进行RAPD扩增产物的琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶电泳比较，为RAPD技术在核桃中的科学与合理利用提供依据。同时，我们对20个随机扩增片段的序列进行了测序分析，为更好地认识RAPD技术的实质以及该技术在核桃品种鉴定和遗传分析等方面的合理利用提供理论依据。 　　 　　1、材料与方法 　　 　　1.1　材料 　　试验材料来自山东省果树研究所试验五分场的国家核桃资源圃内，共16个样本。编号及名称见，表1。 　　1.2　DNA提取 　　采用张虎平等的改良CTAB法从核桃幼叶中提取基因组DNA，利用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，Eppendoff公司生产的Bio-Photometer核酸检测仪检测DNA溶液浓度与纯度，最终将浓度稀释至30ng/μl。 　　1.3　引物筛选 　　采用上海英骏生物技术公司生产的11个碱基的随机引物，利用德国Eppendorf公司生产的Mastercycler ep gradient普通梯度PCR仪连续两次PCR梯度筛选，可产生清晰且扩增稳定的引物。 　　反应体系为15μl，包括ddH2O 8.3μl，10×Buffer 1.5μl，25 mmol/L Mg2+1.2μl，2.5 mmol/LdNTPs1.8μl，10 pmol/μl引物1.2山，30 ng/μl模板DNA lμl，5 U/μlDNA polymerase 0. 08μl。反应程序为：94℃预变性5 min；然后94℃变性50 s，35-45℃复性1min 20s，72℃延伸2min，共43个循环；最后72℃延伸10min，结束后保存在4℃条件下。扩增产物在1.3％琼脂糖凝胶中电泳30-40min，溴化乙锭染色，紫外灯下观察拍照。选择扩增条带清晰不弥散且稳定的温度作为PCR扩增的最适退火温度。 　　1.4　PCR扩增 　　反应体系和反应程序同引物筛选部分，不同引物根据表2中所列的退火温度依次更改。 　　1.5　扩增产物电泳 　　琼脂糖凝胶电泳同引物筛选部分所述，聚丙烯酰胺