第十八章 免疫学检测技术及其应用eq8agd8n.pptVIP

2. 免疫荧光法(异硫氰酸荧光素、藻红蛋白) 直接法 ：用已知荧光标记的抗体检测未知抗原。 间接法： 用荧光标记的抗抗体，检测未知的抗原/抗体。 补体法： * * 3. 放射免疫测定（RIA） 将放射性核素分析的高度灵敏性与抗原抗体反应的特异性结合起来的技术，测定激素和药物。 常用I125和I131 快速，敏感（pg)，但污染环境，有一定的危害性。 * 4. 免疫胶体金技术（ICS） Immunological colloidal gold signature 是用胶体金颗粒标记抗体或抗原，用以检测未知抗原或抗体的技术，可用于多种液相免疫测定和固相免疫分析。 免疫层析法：immunochromatography * 免疫层析法操作和原理 ①首先将已知特异性抗体固定于硝酸纤维素膜上某一区带； ②测试时将上述硝酸纤维素膜一端浸入待检样品中（尿液或血清），通过毛细管作用样品将沿膜向前移动； ③当样品进入特异性抗体固定区带时，若样品中含有相应抗原即可与该区带抗体特异性结合，进而通过免疫胶体金所呈现的紫红色条带判定试验结果。 * 早孕诊断（硝酸纤维素膜诊断试纸制备） ①首先将胶体金致敏抗体—胶体金标记的鼠抗人绒毛膜促性腺激素（HCG）特异性抗体，松弛附着在玻璃纤维上，再将上述玻璃纤维固定在硝酸纤维素膜G处； ②将鼠抗人HCG特异性抗体固定在硝酸纤维素膜T处； ③将兔抗鼠IgG抗体（二抗）固定在硝酸纤维素膜C处； ④硝酸纤维素膜最下方A处（附吸水纸）是滴加待检或接触尿液部位，在硝酸纤维素膜最上方B处有吸水纸，有助于形成毛细管层析作用。 * 早孕诊断（原理 ） 将待检尿液滴加在检测试纸A区，或将检测试纸A区插入待检尿液中，通过层析作用待检尿液向B区移动，流经G区时将胶体金标记HCG抗体从玻璃纤维上复溶，若待检尿液中含有HCG，即形成胶体金标记抗体-HCG复合物；上述复合物迁移至T区时，可被固相HCG抗体识别结合，形成固相HCG抗体-HCG-胶体金标记抗体复合物，胶体金聚集呈现阳性紫红色检测线；剩余胶体金标记抗体迁移到C区与兔抗鼠IgG抗体（二抗）结合，胶体金聚集呈现紫红色质控线。 * 胶体金免疫层析双抗夹心法试验原理示意图 * 早孕诊断（结果分析） ①测试纸条出现两条紫红色反应线：为早孕阳性； ②测试纸条检测线颜色弱于质控线：为早孕弱阳性； ③测试纸条仅在质控线呈现紫红色条带：为早孕阴性； ④测试纸条质控线处无紫色条带出现：为试验无效。 * 5. 化学发光免疫分析（CLIA） Chemiluminescence immunoassay 标记物：鲁米诺等。 是将化学发光分析和免疫反应相结合而建立的一种新的免疫分析技术。 * 6. 免疫印迹法（Western blotting) 先将抗原经SDS电泳分开，再将分开的蛋白质转印到醋酸纤维膜上，然后放入含有抗体的溶液中，洗去未结合抗体，再加标记的二抗，通过显色或发光显示结果。 * 第二节 免疫细胞及其功能检测 * 葡聚糖-泛影葡胺密度梯度离心法: Before centrifuge After centrifuge Fig.1 Fig.2 一、外周血单个核细胞的分离 * 二、淋巴细胞及其亚群的分离 1. 玻璃粘附法 2. 尼龙毛分离法 3. E花结分离法 T细胞 羊红细胞 * 4. 免疫吸附分离法（洗淘法） * （immune magnetic bead, IMB） 将已知抗细胞表面标记的抗体交联在磁性微珠上，与细胞悬液作用后置于磁场中，借磁力的作用将磁珠结合的细胞分开。 5. 免疫磁珠分离法 * 6. 流式细胞术（flow cytometry）分离法 细胞用荧光素标记的抗体染色， 通过流式细胞仪检测。 检测T细胞总数: 抗CD3 检测CD4+/ CD8+T细胞: 抗CD4/CD8 检测B细胞: 抗SmIg * * 三、淋巴细胞功能测定 （一）T细胞功能测定： 1. T细胞增殖试验：淋巴细胞转化试验 观察在有丝分裂原（PHA、Con A）或特异性抗原刺激下T细胞的增殖反应，测定细胞免疫功能。用3H-TdR法、MTT法测T细胞增殖。 2. 迟发型超敏反应皮肤试验：例如OT试验 * （二）B细胞功能测定 1. 血清免疫球蛋白含量测定 2. 抗体形成细胞测定试验 3. 酶联免疫斑点试验（ELISPOT） * 抗体形成细胞测定试验 溶血空斑形成细胞试验 * （三）细胞毒试验 Tc和NK对其靶细胞有直接的细胞毒作用。 方法：51Cr(铬)释放法 乳酸脱氢酶释放法 凋亡细胞检测法 * 四、吞噬细胞功能测定 中性粒细胞趋化功能的测定 中性粒细胞吞噬功