柠檬酸发酵微生物.pptVIP

第四节 柠檬酸发酵微生物 一、柠檬酸发酵生产菌种 很多微生物都能产生柠檬酸， 如黑曲霉（Asp.niger）、棒曲霉（Asp.claratus）、文氏曲霉（Asp.nentic）、泡盛曲霉（Asp.awamori）、芬曲霉（Asp.fenicis）、淡黄曲霉（Perucillium.lutean）、桔青霉（P.citrium）、二岐拟青霉（Paecilomyces）、梨形毛霉（Mucor.picriforoms）等。 采用不同原料所用菌种不同 淀粉原料：TD-01,初糖浓度20.8%，96h，产酸率20.24%，转化率97.28%. 薯干原料：上海工微所→东酒2号→N-558 →Co827 →T419 初糖浓度18-19%，60-90h，产酸率20.24%，转化率97%。 糖蜜原料：川柠-17-66（四川食品研究所），8668（黑龙江轻工所），产酸14%，性能粗放，抗金属离子能力强，以甘蔗蜜糖不需要黄血盐预处理。 （一）黑曲霉（Asp.niger） 1.形态特征 2.生活周期 无性繁殖 孢子发芽 新孢子成熟 （约50h） 2.培养基 （二）解脂假丝酵母（Candida lipolytica） 以烃类为碳源 1.形态特征 （1）麦芽汁培养：25℃3d，卵形，基部出芽。可能存在假菌丝、真菌丝及节孢子。 （2）麦芽汁琼脂培养： 17℃1个月，菌落奶油色，湿润或无光泽，柔软或粗糙，有微皱或粗皱。 （3）马铃薯或玉米琼脂培养：可形成丰富的假菌丝和真菌丝，并出现芽生孢子，还可能出现节孢子。 2.培养基 黑曲霉是重要的发酵工业菌种，可生产淀粉酶、酸性蛋白酶、纤维素酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、柠檬酸、葡糖酸和没食子酸等。 黑曲霉在pH为2～3的环境中发酵蔗糖，产物以柠檬酸为主，只产极少量的草酸；当pH接近中性时则大量产生草酸， 而柠檬酸产量很低。 1.黑曲霉柠檬酸高产菌的形态特征 黑曲霉柠檬酸高产菌的形态特征 1.在米曲汁或麦芽汁培养基上菌丝白色，不是绒球状，凸起，边缘整齐，菌落较小，带褶皱。 2.在麦芽汁培养基上生长4天成熟的孢子呈黑褐色。 3.在察氏培养基上生长较快（10~14天），菌落边缘整齐，分生孢子梗短，分生孢子着生较密。 2.黑曲霉柠檬酸高产菌的生理特征 ①能耐高浓度柠檬酸（15%以上），而不利用和分解柠檬酸。 ②耐高浓度葡萄糖（18-20%）；能产生和分泌大量的酸性α-淀粉酶和酸性糖化酶，糖化酶最适作用pH在4.0~4.6，最适温度为60~65 ℃。 ③能利用淀粉质、糖蜜、葡萄糖母液等原料发酵生产柠檬酸。 ④能抗微量金属离子，如Mn2+、Zn2+、Cu2+。 ⑤在深层液体通风培养时，能形成大量的细小菌球体，极大地降低发酵液的粘度。 ⑥在以葡萄糖为唯一碳源的合成培养基上，生长不好，生成小菌落，孢子形成能力弱。减弱葡萄糖通过HMP途径（戊糖循环）降解的代谢流。 ⑦在生长、繁殖期，细胞内具有较高水平的氨基酸、NH4+;而蛋白质、核酸水平低。在生长和产酸期，细胞内蛋白质，核酸水平低。 ⑧具有很强的侧系呼吸链活性，此侧系呼吸链不产生ATP。 三、黑曲霉柠檬酸生产菌的分离选育及保藏 自然选育：在生产过程中，不经人工处理，利用菌种自身的突变或直接从自然界中分离筛选的过程。 诱变选育：通过诱变剂处理来提高菌种的突变频率，扩大变异幅度，从中选出具有优良性状的突变株。 （一）黑曲霉柠檬酸生产菌的分离选育 ①收集相当数量的现有菌种，经活化-分离-纯化，从中挑选合适的菌株； ②采集大量的含菌样品，分离筛选出优良菌种。根据黑曲霉的酶系特征，可以从腐烂植物、水果表皮，也可从含有腐烂未熟水果的酸性土壤中分离。 1.纯化培养 分离筛选黑曲霉柠檬酸生产菌常用培养基： 麦芽琼脂、米曲琼脂、马铃薯琼脂、察氏琼脂等。 2.纯化方法 采用平板划线分离、平板稀释分离和小滴分离纯化培养，反复进行数次。 3.摇瓶筛选 从分离平板上，挑出单一菌落，移接到麦芽汁琼脂斜面上，在33℃培养6~7d； 孢子长好后，分别接入2环于三角瓶中，进行摇瓶发酵试验，35~37 ℃、300r/min、发酵60~70h； 用针头注射器抽取发酵液1ml，用0.1mol/L NaOH滴定，产酸高者再进一步测定柠檬酸产量。 从中筛选出产柠檬酸高、糖转化率高且产酸稳定的菌种。 （二）柠檬酸生产菌的诱变育种 诱变育种： 在人为地条件下,利用物理,化学等因素,诱发生物产生突变,从中选择,培育成动植物和微生物地新品种，进而设法从大量的变异群体中筛选出优良的突变株的过程。 诱变剂-能提高菌种突变率的物质。 物理诱变剂：UV、氮离子注入、x射线等（染色体水平上导致突变） 化学诱变剂：（导致更细微的基因水平的突变） 烷基磺酸盐和烷基硫酸盐：EMS