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核转染仪辅助转染肝素酶基因siRNA有效性实验研究 　　摘 要 目的 研究核转染仪转染肝素酶基因siRNA的有效性。方法 采用核转染仪辅助转染技术和常规脂质体转染技术转染针对肝素酶基因启动子区和编码区设计siRNA，并通过实时定量RT-PCR，Western blot等技术检测2种转染技术转染后，肝癌细胞SMCC-7721在48h、72h和96h时肝素酶基因表达情况。结果 2种转染技术在转染后48h，从mRNA和蛋白水平上均能成功干扰掉肝素酶基因；但在转染后72h，脂质体转染组基因很快恢复表达，而核转染仪转染组基因仍保持沉默；在96h后，2组的肝素酶基因均恢复表达。结论 核转染仪可有效转染肝素酶基因siRNA，并使肝癌细胞SMCC-7721的肝素酶基因表达下调，且维持较长时间。 　　关键词 核转染仪 肝素酶基因 肝癌细胞 　　RNA干扰（RNA interferance，RNAi）是近些年在分子生物学中迅速发展起来的一项新技术，是基因功能研究最常用手段之一[1]；它包括转录水平（Transcriptional gene silencing ，TGS）和转录后水平（post-transcriptional gene silencing， PTGS）2种基因沉默方式[2]。通常所说的RNAi指的是PTGS，通过基因编码区设计的小分子RNA（siRNA）能与对应的mRNA靶序列特异结合，并使靶序列降解，从而使基因沉默[1]。由于基因上游转录水平持续活跃，不停地产生大量mRNA，要使基因持久沉默，就得不停地给予外源性siRNA。因此，PTGS的干扰效率不高。研究发现植物细胞存在高效率的TGS现象，即在DNA水平上通过基因5’端启动子区域DNA甲基化或组蛋白去乙酰化形式使基因永久沉默；这种现象被称为siRNA指导下的DNA甲基化（siRNA-direct DNA methylation）或组蛋白修饰[3，4]。2004年Kawasaki 等[5]首次发现在人细胞也存在TGS现象。理论上讲，一次给予针对基因5’端启动子的siRNA，就可使该基因由于表观遗传修饰而保持持久沉默[6～8]。因此，TGS相对于PTGS的研究更具有经济性和临床应用前景[9]。肝素酶基因（heparanase gene，HPA）位于人染色体4q 21.3，其5’端启动子区域含有CpG岛，表明基因的表达受甲基化等表观遗传学机制调控[10]；HPA在肝癌、乳腺癌、大肠癌、肺癌和淋巴瘤等多种肿瘤中都有高水平的表达[11～13]，主要参与肿瘤转移和侵袭。然而，TGS的沉默对象是位于细胞核中的非编码DNA调控序列，siRNA必须进入细胞核内才能发挥作用。近年由于核转染技术发展，尤其是德国AMAXA公司研发的NucleofectorTM专利创新技术，它采用电穿孔技术与细胞类型特异的核转染溶液结合方法，直接将DNA序列转入细胞核内，即使是常规转染无法转染的原代培养细胞和不分裂细胞也可成功转染，其转染率可高达70%以上，速度快，转染2h后就能发挥作用，操作简单方便[14，15]。但目前尚未见该技术用于TGS研究，既往TGS研究采用常规脂质体转染技术。本研究采用HPA基因为模型，比较核转染仪辅助转染技术和常规脂质体转染技术在肝素酶基因沉默效果和沉默维持时间上的差别。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　DMEM培养基、胎牛血清、含100 U/mL青霉素、100 U/InL链霉素的青链霉素混合液均购自Gibco公司，SMMC-7721细胞（中科院上海细胞所），NucleofectorTM电转试剂盒（德国Amaxa公司），德国Amaxa公司单孔核电转仪，型号2b（北京达科维生物公司提供），Trizol试剂（invitrogen公司），逆转录试剂盒（fermentas公司），2×Taqmix（ABI公司），兔抗人肝素酶多克隆抗体、HPR标记羊抗兔抗体（Santa公司），PVDF膜（ Santa 公司），发光试剂盒，Transwell小室（BD公司）；Lipofetmiane 2000试剂盒（美国Invitrogen）。 　　1.2 方法 　　1.2.1 细胞培养 从液氮中取出SMMC-7721细胞，42℃热水迅速复苏，用高糖DMEM加10%的血清和1%的青链霉素混合液，放入37℃、5%CO2、常规湿度培养箱中培养。 　　1.2.2 干扰片段设计 针对肝素酶基因启动子区，分别设计多个干扰片段（siRNA），在预实验中筛选出干扰效果较理想的siRNA；TGS的 siRNA为：GAGGAAGUGCUAGAGACUCU；同时对HPA基因编码区设计RNAi片段：CCUUAAGAAGGCUGAUAUU（图1），整个设计合成由美国BIOO公司协助完成，设计完成后的siRNA经过