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氯菊酯微生物手性降解研究 　　摘要：通过对河北省石家庄市的黄土进行取样、筛选、分离，得到1株以氯菊酯为唯一碳源的细菌，命名为 PM-A，经鉴定为萎蔫短小杆菌（Curtobacterium flaccumfaciens）。此菌对氯菊酯有良好的降解能力，采用一级动力学模拟，半衰期为1.41 d。进一步考察对各异构体的降解情况，顺式体和反式体降解差异不明显，对顺式体的1对对映体（1R-cis 和1S-cis）降解不存在对映体选择性，对反式体的1对对映体（1R-trans和1S-trans）降解存在明显的对映体选择性。 　　关键词：氯菊酯；萎蔫短小杆菌；手性；降解；对映体；对映体选择性 　　中图分类号： X172；X592 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2017）20-0282-03 　　手性农药的不同对映体往往具有不同的生物活性和生理毒性，其在环境中的消解和归趋也有较大的差别，对环境样品中手性农药的分析和检测往往显示不同的对映体比值[1-2]。土壤是农药残留的主要场所，土壤微生物代谢也是手性农药降解和产生对映体差异的主要原因，目前关于环境样品中手性农药的分析检测及降解特征有较多的研究[3-6]，但在微生物水平考察手性农药对映体差异的报道较少[7-8]。 　　拟除虫菊酯是一类重要的农用杀虫剂，在卫生杀虫领域也有广泛的应用。菊酯的结构较为复杂，一般含2～3个手性中心，因此有4～8个对映异构体，氯菊酯（permethrin）是拟除虫菊酯的重要品种，化学式为C21H20Cl2O3，化学名为3-苯氧基苄基-2，2-二甲基-3-（2，2-二氯二烯基）-1-环丙烷羧酸酯，结构式如图1所示。氯菊酯含有2个手性中心，有1个顺式体和1个反式体，顺式体和反式体又各含有2个对映异构体，因此共有4个对映体，分别为1R-cis、1S-cis、1R-trans、1S-trans，氯菊酯各异构体的生物活性和降解行为均有较大差异[7]。本研究通过对河北省石家庄市的黄土进行筛选和纯化，得到1株氯菊酯的优势降解菌，该菌株以氯菊酯为唯一碳源，且对氯菊酯具有良好的降解能力。在此基础上进一步研究氯菊酯各异构体的手性测定方法，考察该菌株对各异构体的降解差异，结果有助于阐释菊酯农药在环境中的对映体选择性行为，也能为菊酯农药的生物修复提供依据。 　　1 材料与方法 　　1.1 仪器与试剂 　　安捷伦1200型高效液相色谱仪（带G1314B紫外检测器），购自安捷伦科技有限公司；可见分光光度计（spectrunm 722型），购自上海美析仪器有限公司；ZWY-240型恒温摇床，购自上海智诚分析仪器制造有限公司；SPX-250B生化培养箱，购自上海贺德实验设备有限公司。石家庄黄土，采自河北科技大学新校区，pH值7.68，有机质含量2.26%；99%氯菊酯，购自上海市农药研究所有限公司；正己烷、乙酸乙酯、异丙醇等均为分析纯，均购自天津大茂化学试剂厂，重蒸后过0.45 μm有机滤膜备用；其他化学试剂和生物试剂均购自河北石家庄天时生物技术有限公司。富集培养基：10 g蛋白胨、1 g NaCl、1 g KH2PO4、1 000 mL水 （pH值7.0～72）；普通培养基：3 g牛肉膏、10 g蛋白胨、5 g NaCl、1 000 mL水（pH值 7.0～72）；基础培养基：1.00 g NH4NO3、0.50 g MgSO4?7H2O、0.50 g （NH4）2SO4、0.50 g KH2PO4、0.50 g NaCl、1.50 g K2HPO4、0.05 g酵母浸粉、1 000 mL水（pH值7.0～7.2），固体培养基在此基础上加入2 %琼脂粉。 　　1.2 色?V柱和色谱条件 　　非手性高效液相色谱（HPLC）的色谱柱为正相硅胶柱（购自辽宁大连依利特分析仪器有限公司，250 mm × 4.6 mm），流动相为正己烷 ∶ 异丙醇（体积比为100 ∶ 0.08）。手性HPLC色谱柱为Chiralcel OJ-H（购自日本大赛璐工业株式会社，250 mm × 4.6 mm），流动相为正己烷 ∶ 异丙醇（体积比为100 ∶ 2）。非手性和手性HPLC的检测波长均为 230 nm，流速为 1.0 mL/min，进样量为20 μL。 　　1.3 氯菊酯降解菌的筛选 　　向250 mL三角瓶中加入100 mL富集培养基，在高压蒸汽锅中灭菌15 min，自然冷却后加入10 mL氯菊酯（100 mg/L）和10 g石家庄黄土，在摇床（温度30 ℃、转速180 r/min）中培养7 d。此后按10 %的接种量转接到下一批含氯菊酯（质量浓度依次为100、200、300、400、500 mg/L）的富集培养基中，相同条件下各培养7 d，然后按10 %的接种量转接到含有5