4_生物大分子相互作用分析解析技术(基础医学跟医学实验技术).pptVIP

第六章 生物大分子相互作用 分析技术 基础医学院 主要内容 第一节 生物大分子相互作用分析的意义 第二节 常见的生物大分子相互作用分析方法 第三节 生物大分子相互作用分析新进展（FRET、SPR） 真核生物细胞 eukaryotic cell 原核生物细胞 prokaryotic cell 细胞中的大分子 Macromolecules in Cells 第一节 生物大分子相互作用分析的意义 蛋白质组学的分类 表达蛋白质组学 Quantitative study of protein expression between samples that differ by some variable 结构基因组学 Goal is to map out the 3-D structure of proteins and protein complexes 功能蛋白质组学 To study protein-protein interaction, 3-D structures, cellular localization and PTMs in order to understand the physiological function of the whole set of proteome. 蛋白质信息的不同层次 蛋白质结构和序列特点 蛋白质进化过程和保守序列 蛋白质表达谱 蛋白在细胞内的定位及其相关联的细胞器或结构 蛋白质翻译后修饰情况 了解与其相关联的其他细胞蛋白质 第二节 生物大分子相互作用分析技术 生物大分子相互作用分析研究思路 1.GST融合蛋白技术 （GST pull-down assay） ——基于重组蛋白表达纯化技术的体外分析系统 Tags Pull-Down 方法的组成 GST pull-down 应用 鉴定未知相互作用的蛋白 鉴定预测的或已知的相互作用 GST pull down验证两种已知蛋白质（X-Y）的相互作用 2. 免疫共沉淀（ immunoprecipitation，Co-IP ） ——非常有效地用于鉴定细胞内生理上的蛋白质相互作用的分析技术 实验设计思路 实验流程 Co-IP 应用 鉴定已知蛋白质相互作用的检测 鉴定新蛋白质间的相互作用 免疫共沉淀验证两种已知蛋白质的相互作用 3.串联亲和纯化（Tandem Affinity Purification，TAP） 串联亲和纯化技术的优势 与传统的生化纯化方法相比 实验设计思路 实验流程 4. 酵母双杂交（ yeast two-hybrid system ） 酵母双杂交（ yeast two-hybrid system ） 实验设计思路 酵母双杂交方法的优势及缺陷 优势： 酵母双杂交方法的应用 高灵敏度地检测蛋白－蛋白的相互作用 确定蛋白相互作用的结构域或重要活性位点 寻找与靶蛋白相互作用的新蛋白 寻找具有药物治疗作用的小分子肽 寻找控制蛋白相互作用的化合物 蛋白相互作用图谱的绘制 酵母双杂交结果 X-β-半乳糖苷酶蓝白斑显色分析 酵母双杂交测序结果 5.噬菌体展示技术（Phage display） 特 点 该技术的主要特点是将特定分子的基因型和表型统一在同一病毒颗粒内，即在噬菌体表面展示特定蛋白质，而在噬菌体核心DNA中则含有该蛋白的结构基因。另外，这项技术把基因表达产物与亲和筛选结合起来，可以利用适当的靶蛋白将目的蛋白或多肽挑选出来。 Used for cloning foreign genes among other applications Proteins and peptides are fused to the Capsid (surface) of the phage The combination of the phage and peptide is known as a Fusion Protein pIII 和pVIII 噬菌体展示系统 优点： 　　A. 高通量的淘选：将靶标分子（抗体）固定在固相载体上，加入噬菌体展示肽库（噬菌体的数量可达1011 PFU），利用抗原-抗体的特异性亲和力将与抗体结合的噬菌体吸附在固相载体上，不能结合的噬菌体仍在溶液中，可以通过洗涤去除，再将特异结合的噬菌体洗脱下来，如此反复数轮扩增、淘选，即可将有用的基因从多达百万以上的噬菌体克隆中分离出来。 　　B. 可用于模拟表位的筛选 ：利用噬菌体展示技术得到模拟表位的报道较多模拟表位同样可诱发与天然表位相似的特异性免疫反应，例如利用乙肝病毒的模拟表位免疫小鼠可诱导产生高滴度的乙肝病毒抗体。 　　C. 易于纯化 重组噬菌体的纯化步骤简单、不要求昂贵的试