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秋水仙胺诱导牛卵母细胞显核研究 　　摘要：为了观察秋水仙胺（demecolcine，DEME）诱导牛卵母细胞的显核效果，从吉林省长春市某屠宰场收集牛卵巢后采用抽吸法获取卵泡液，在体视显微镜下选择卵丘完整、胞质均匀的卵丘-卵母细胞复合体（COCs），微滴法体外成熟（invitromature，IVM）培养19～22h，在0.3%透明质酸酶中旋涡振荡去除卵母细胞周围的卵丘细胞，挑选排出第一极体的卵母细胞随机分组，分别进行DEME浓度和作用时间诱导牛卵母细胞显核的研究。结果表明，DEME处理60、90、120min组间显核率差异不显著（P0.05），但是60、120min组的显核率显著高于DEME处理30min组（P0.05）。牛的COCs经IVM培养19、20、21、22h，结果发现培养22h组显核率最高，显著高于培养19h组（P0.05）。可见牛卵母细胞经IVM培养20～22h后，用0.5μg/mLDEME处理60min可以有效诱导其显核。 　　关键词：地美可辛；牛；卵母细胞；体外成熟；化学辅助去核 　　中图分类号：S823.2文献标志码：A 文章编号：1002-1302（2014）11-0228-03 　　自1997年第1只体细胞核移植动物――“多莉”诞生[1]以来，体细胞核移植技术已经发展十几年的时间，由于其在核质互作、濒危动物保护方面具有深远的应用前景[2]，同时可利用的大量濒危动物卵母细胞通常很难获得，而屠宰场屠宰后的母牛卵巢方便获取且易获得大量卵母细胞作为受体胞质，利用其进行种间体细胞核移植技术研究在当前较广泛。但是包括牛在内的家畜卵母细胞不像鼠科动物的卵母细胞在光学显微镜下可以直接看到细胞核[3]，所以通常去核时采用盲吸法[4]、荧光辅助法[5]或秋水仙胺（demecolcine，DEME）诱导显核法[6]。利用盲吸法去核时为了提高去核效率通常要去除较大体积的胞质，之后还需要在紫外光下照射以确定去核成功率，这会给受体胞质造成不可逆的伤害，而荧光辅助法去核法同样需要对卵母细胞进行紫外光照射，具有同样或更重的伤害[7]。DEME诱导显核法利用DEME对受体卵母细胞处理后能够破坏其微管稳定性、干扰染色体的正常分离和纺锤体的功能促进核内所有染色质聚集在胞质表面形成一个突起，去核时仅去除极少量的胞质即可达到完全去核的目的，去核后在没有DEME的培养液中培养时即可恢复微管的聚集[8]。本试验就牛卵母细胞经过微滴法体外成熟（invitromature，IVM）不同时间后用DEME处理对其显核情况进行研究，旨在确定DEME诱导去核时的适宜浓度和处理时间，以满足体细胞核移植研究需要，为其进一步应用奠定基础。 　　1材料与方法 　　1.1药品与试剂 　　DEME和丙酮酸钠购自西格玛奥德里奇公司，人绒毛促性腺激素（hCG）和孕马血清促性腺激素（PMSG）购自浙江省宁波市三生药业有限公司，其余试剂均购自生命科技公司。 　　1.2卵巢的获取及卵母细胞的收集 　　卵巢采集于吉林省长春市某屠宰场，母牛屠宰后立即采取卵巢将其放入含有双抗的25～35℃生理盐水中，8h内带回实验室。将收集的卵巢剪去附着的系膜和输卵管，用灭菌生理盐水清洗3次后，用带有16号针头的10mL注射器抽吸法收集卵泡液，在体视显微镜下选择卵丘完整、胞质均匀的卵丘-卵母细胞复合体（cumulus-oocyte-complexes，COCs）用含5%FBS的PBS洗净。 　　1.3卵母细胞体外成熟 　　将挑选好的COCs用成熟液洗3次，然后移入平衡2h以上的微滴成熟液中，放入38.5℃、饱和湿度、5%CO2条件下培养。卵母细胞成熟培养液组成为90%M199+10%FBS+10μg/mLPMSG+10μg/mLhCG+0.33mmol/L丙酮酸钠，成熟培养19～22h后置于含3mg/mL透明质酸酶的DPBS中，涡旋混合器振荡去掉卵母细胞周围的卵丘细胞，检查成熟情况，以体视显微镜下观察到卵丘细胞扩展（图1）及排出第一极体（图2）视为成熟。 　　1.4试验设计 　　试验一：IVM培养21h后，挑选成熟的卵母细胞随机分组，洗净后放入含0.4μg/mLDEME和10%FBS的M199微滴培养液中，在38.5℃、饱和湿度CO2培养箱中培养30、60、90、120min，在体视显微镜下观察显核情况（图3）。 　　试验二：IVM培养21h后，挑选成熟的卵母细胞随机分组，洗净后放入含0.3、0.4、0.5、0.6μg/mLDEME和10%FBS的M199微滴培养液中，在38.5℃、饱和湿度CO2培养箱中培养60min，在体视显微镜下观察显核情况（图3）。 　　试验三：IVM培养19～22h后，挑选成熟的卵母细胞洗净后放入含0.5μg/mLDEME和10%FBS的M199