禽病源性大肠杆菌E058株neuC基因突变株构建及致病性.docVIP

禽病源性大肠杆菌E058株neuC基因突变株构建及致病性 　　摘要：运用Red重组系统构建E058ΔneuC基因缺失突变株。细菌生长曲线结果，突变株E058ΔneuC比野生株E058的生长速度稍慢。在血清杀菌试验中，与野生株E058相比，E058ΔneuC在血清中的存活率显著下降。体外竞争结果表明，突变株E058ΔneuC毒力被轻度的致弱。体内动态分布试验中，E058ΔneuC突变株在受检脏器中的细菌数较APECE058株均明显下降，在心、肝、脾、肾中极显著下降，在肺中也极显著下降。结果表明，neuC基因与APECE058株的致病性有较强关联性。 　　关键词：禽病源性大肠杆菌；neuC基因；突变株；致病性 　　中图分类号：S852.61+2文献标志码：A文章编号：1002-1302（2014）11-0234-03 　　禽大肠杆菌病由禽源性大肠杆菌引起，造成局部或全身性感染，包括大肠杆菌性蜂窝织炎（炎性过程）、Hjarre氏病（肉芽肿）、败血症、气囊病、腹膜炎、滑膜炎/骨髓炎、脐炎/卵黄囊感染、肿头综合征、输卵管炎、全眼球炎等，大肠杆菌病对养禽业造成严重的经济损失，在禽病调查中疾病是胴体报废的主要原因，禽肉加工中43%肉鸡胴体的报废与大肠杆菌病有关[1-2]。禽病原性大肠杆菌致病相关的毒力因子已相继报道，如Ι型菌毛、P菌毛、荚膜、脂多糖复合物、铁摄取系统（气杆菌素、铁系统和耶尔森氏菌强毒力岛等）[3-4]、空泡形成毒素（vacuolatingautotransportertoxin，VAT）[5-6]、侵袭素IbeA[7]等。[LL]禽大肠杆菌病不仅有复杂的致病机理，而且部分的毒力因子功能还有待进一步明确。 　　本研究从我国分离的禽病原性大肠杆菌E058株（O2血清型）在芯片杂交试验中获得的表达差异片段中选取neuC基因片段为研究对象[8]，构建E058ΔneuC突变株，通过动物试验，探讨基因neuC和E058株致病性之间的关系。 　　1材料与方法 　　1.1材料 　　1.1.1菌株和质粒菌株和质粒见表1。 　　1.1.3主要试剂 　　TaqDNAPolymerase、T4连接酶、DNaseⅠ购自Fermentas公司；dNTP、DNA限制性内切酶、DNAmarker购自大连TaKaRa公司；PCRcleanupkit、AgaroseGelDNAPurificationKit购自杭州AXYGEN公司；SDS、NaAc、EDTA、ATP、Casaminoacids，2′，2′-dipyridyl购自Sigma公司；L-阿拉伯糖购自BioBasic公司；Tryptone、Yeastextract为Oxoid产品；其他试剂均为国产分析纯级产品；抗生素使用浓度为：氨苄青霉素60μg/mL、卡那霉素50μg/mL。 　　1.1.4试验鸡 　　SPF鸡由北京梅里亚维通试验动物技术有限公司提供，SPF种蛋本室自行孵化。 　　1.2方法 　　1.2.1分子生物学及数据分析软件 　　PrimerPremier5.0引物设计软件；Lasergene序列分析软件；GraphPadPrism5数据分析软件。 　　1.2.2T-neuC-Kan重组质粒的构建 　　以E058野生株基因组DNA为模板，采用普通PCR扩增neuC基因。应用neuC-F/neuC-R引物，用0.8%琼脂糖凝胶电泳进行PCR鉴定。PCR产物经鉴定是预期大小的片段，然后用AgaroseGelDNA胶回收试剂盒回收纯化DNA片段。将纯化回收的neuC基因片段直接克隆入pMD?18-T载体中。采用CaCl2法按《分子克隆》所述步骤进行将连接产物进行转化，涂板，完成感受态细胞的制备，参照《分子克隆》相关步骤[9-10]进行菌落挑取，进行培养，以及提取小量的质粒；提取质粒后再进行BamHⅠ-HindⅢ双酶切的鉴定，鉴定正确即为重组质粒T-neuC。设计1对引物，上游引物T-neuC-F的5′端引入EcoRⅠ位点；下游引物T-neuC-R的5′端引入EcoRⅠ位点。上、下游引物扩增片段约为3.2kb。以重组质粒T-neuC为模板，反向PCR扩增T-neuC片段。将纯化回收反向扩增的T-neuC片段和pUC4K质粒分别用EcoRⅠ酶切。将回收的反拉T-neuC片段与酶切下来的Kan片段连接。将连接产物涂板，再挑取菌落、培养和质粒的小量提取等，质粒提取后分别用EcoRⅠ酶切鉴定，电泳鉴定，正确的质粒委托专业检测公司完成测序验证，测序鉴定正确的即为重组质粒T-neuC-Kan。 　　1.2.2电转化亲本株E058构建突变株E058ΔneuC 　　将PCR扩增的T-neuC-Kan片段电转化到含有感受态细胞的E058中，通过Red重组系统构建突变株E058Δn