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细菌来源丙氨酸脱氢酶研究进展 　　[摘 要] 丙氨酸脱氢酶（Alanine dehydrogenase, ALD, EC 1.4.1.1）是一种以烟酰胺腺嘌呤（NAD）为辅酶的氨基酸脱氢酶。丙氨酸脱氢酶可逆催化丙氨酸氧化脱氨生成丙酮酸、氨以及NADH。丙氨酸脱氢酶也是调节氨基酸代谢和糖代谢有关的重要酶类，催化反应的产物丙酮酸广泛应用于医药、农药、食品等领域, 具有良好的发展前景。本文主要介绍了细菌中丙氨酸脱氢酶的纯化及活力检测、酶空间结构（底物结合位点）、催化反应机理等方面的研究。 　　[关键词] 丙氨酸脱氢酶 反应机理 丙酮酸 烟酰胺腺嘌呤 脱氢酶 　　 　　基金项目：河北省自然科学基金（C2011205045）、河北省留学回国人员资助项目、河北省科技支撑项目）、河北师范大学博士启动基金项目（L2009B13） 　　丙氨酸脱氢酶可逆催化丙氨酸氧化脱氨生成丙酮酸，同时还原NAD+生成NADH，它可以受琥珀酸、苹果酸、α-酮戊二酸、丙酮酸等的诱导产生，同时丙氨酸脱氢酶调节酮酸和氨基酸的稳态平衡，在氨基酸和酮酸合成中至关重要。丙氨酸脱氢酶也是与氨基酸代谢和糖代谢有关的酶，它在调节糖代谢和氨基酸代谢中也起重要作用。产物丙酮酸在医药工业中常常被用于合成消炎镇痛药辛可芬、抗结核药异烟肼丙酮酸钙、驱虫药恩波吡维胺以及抗病毒剂氮杂喹喔啉等，也可作为饲料和食品添加剂，具有很好的防腐保鲜功能，还可作为生物技术诊断试剂、检定脂肪的显色剂、减肥保健品等。 　　丙氨酸脱氢酶自1955年被鉴定以来，目前已经有很多关于丙氨酸脱氢酶的研究报道，特别是近年来通过晶体结构解析酶蛋白空间结构，为深入阐述丙氨酸脱氢酶的催化机理提供了更为有利的条件；同时也为根据反应底物酮酸合理开发新的抗病毒类药物和生物制品提供理论基础。本文主要介绍细菌中丙氨酸脱氢酶的纯化、活性检测、蛋白空间结构（底物结合位点）及其催化反应机理等。 　　一、丙氨酸脱氢酶的来源 　　丙氨酸脱氢酶分布广泛，在细菌、植物和真核藻类都有发现，并在微生物的碳氮代谢中起关键作用，包括在孢子形成过程中以L-ala为主要能源，通过三羧酸循环提供能量，同时还参与固氮作用（氨同化）保证生物体氮源充足。在动物体中也存在丙氨酸脱氢酶，主要作用是平衡机体内的糖代谢和氨基酸代谢，尤其是机体在极端条件下，该酶催化产生大量的丙酮酸，为机体提供能量。 　　二、酶蛋白的纯化及活力测定 　　丙氨酸脱氢酶的纯化方法主要有硫酸铵分级沉淀、DEAE-纤维素离子交换柱层析、亲和镍柱层析和分子筛柱层析的方法，通过以上两个或两个以上方法联用足以纯化获得较均一的酶蛋白。酶活力的测定一般是通过反应底物的减少或反应产物的增加来衡量酶活力的强弱高低，一般测定的是产物增加的量，也就丙酮酸的增加量，下面将简要介绍几种测定方法： 　　1、紫外分光光度法 　　该方法是通过检测反应产物丙酮酸的生成量来计算酶活力。该方法是根据丙酮酸在紫外吸收光谱290～340nm区有较强的光吸收而建立的紫外分光光度法。在pH11.0的水溶液中,在320nm波长下,只有丙酮酸有吸收,而其它有机酸和杂质无吸收或吸收不明显，这避免了其他酸类的影响（pH大于7.0后丙酮酸的吸光值基本恒定）。 　　2、相对滴定法 　　相对滴定是将不同被测物溶液滴到相同的状态时所消耗滴定剂的体积与被测物含量成正比为定量基础的滴定分析方法。将其应用于极弱酸碱的滴定，无需确定化学计量点，能消除经典滴定法中由于化学计量点和滴定终点不重合带来的终点误差。 　　3、高效液相色谱法 　　HPLC主要是通过丙酮酸的紫外吸光波长进行测量，样品通过HPLC柱时不同物质的流出时间和保留时间不同，样品含量不同在色谱图上的峰值也不相同，根据丙酮酸在色谱图上的峰面积计算出丙酮酸的含量。HPLC操作简单方便，能灵敏的检测到样品中的丙酮酸量，常用于实验分析；本方法的不足之处是对仪器设备的要求高，成本投入较大。 　　4、颜色反应 　　此法是基于在L-丙氨酸脱氨反应中除加辅酶NAD+外，还加入了PhenazineMethosulfate（吩嗪硫酸甲酯）和NitroblueTetrazolium(氮蓝四唑，硝基四氮唑)，整个反应中添加这两种物质后，在37°C下作用10min，得到的反应液呈紫色，在595nm处有吸光值。此方法的特点是反应简单，颜色反应效果明显易观察。另外，基于此原理，通过非变性电泳进行活性染色能够较为方便鉴定酶蛋白的活性功能。 　　三、丙氨酸脱氢酶的空间结构 　　丙氨酸脱氢酶存在四聚体、六聚体和八聚体三种结构，不同来源的丙氨酸脱氢酶结构有所不同。来自P.Lapdeum，M.tuberculosis，E.aerogenes的丙氨酸脱氢酶表现为六聚体，亚