系统性红斑狼疮患者治疗后外周血单个核淋巴细胞B淋巴细胞活化因子和受体表达变化研究.docVIP

系统性红斑狼疮患者治疗后外周血单个核淋巴细胞B淋巴细胞活化因子和受体表达变化研究 　　[摘要] 目的 对比治疗前后系统性红斑狼疮（SLE）患者外周血单个核淋巴细胞（PBMCs）B淋巴细胞活化因子（BAFF）和B淋巴细胞活化因子受体（BAFF-R）mRNA表达水平的变化。 方法 收集SLE初发患者14例，所有患者SLEDAI评分均大于10分，分别于治疗前和治疗后12周收集血液标本，应用实时荧光定量反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）法检测SLE患者外周血PBMCs BAFF和BAFF-R mRNA表达水平。同时，纳入10例健康者进行对照。 结果 治疗后14例SLE患者SLEDAI评分均低于10分，病情稳定，SLE患者组治疗前、治疗后12周PBMC BAFF和BAFF-R mRNA表达水平与正常对照组相比明显升高（P0.05）。患者组治疗后12周与治疗前相比PBMC BAFF和BAFF-R mRNA表达水平显著下降（P0.05）。 结论 SLE患者PBMCs BAFF和BAFF-R mRNA表达水平随病情好转而下降，可以作为疾病活动性指标。 　　[关键词] 系统性红斑狼疮；B淋巴细胞活化因子；B淋巴细胞活化因子受体；实时荧光定量反转录-聚合酶链反应 　　[中图分类号] R593.24 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2013）08（c）-0043-03 　　系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）是一种累及多脏器的自身免疫性疾病，存在B淋巴细胞过度活化。B淋巴细胞活化因子（B cell activating factor，BAFF）是近年发现的肿瘤坏死因子（TNF）家族的新成员，主要作用是调节B淋巴细胞的功能。新近发现的BAFF第三种受体BAFF-R，是BAFF的特异性受体，两者结合后，参与调节B细胞内稳态失调。本课题研究SLE患者治疗前后BAFF与BAFF-R的表达，探讨BAFF与BAFF-R在SLE发病机制中的作用和意义，为SLE的病情发生、发展及治疗后评估提供新的思路和评价指标。 　　1 资料与方法 　　1.1 临床资料 　　选择2010年1～10月山西医科大学第二医院和解放军二六四医院风湿科住院SLE患者14例，均符合美国风湿病协会1997年修订的SLE诊断标准；其中，男性1例，女性13例，年龄18～44岁，平均（32.05±12.42）岁。有慢性感染病史、恶性肿瘤、高血压、糖尿病及严重的心脑血管疾病者除外。治疗采用醋酸泼尼松（1～2 mg/kg），环磷酰胺（800～1000 mg，3～4周应用1次）。正常对照组10例，年龄20～41岁，平均（28.76±7.29）岁。所有入组患者SLEDAI评分均大于10分，经治疗后14例患者均病情稳定（以SLEDAI评分低于10分为病情稳定）。 　　在治疗前、治疗后12周观察SLEDAI评分变化，实时荧光定量RT-PCR检测外周血单个核淋巴细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs） BAFF和BAFF-R mRNA表达水平。 　　1.2 主要试剂与仪器 　　B320A型医用低速离心机（白洋离心机厂），人淋巴细胞分离液（中国医学科学院生物工程科学研究所），Trizol（TaKaRa公司），氯仿（北京化工厂），异丙醇（北京化工厂），反转录试剂盒（TaKaRa公司），PCR试剂盒（TaKaRa公司）。 　　1.3 方法 　　1.3.1 PBMC的提取：抽取SLE患者及健康对照组静脉血各10 ml，加淋巴细胞分离液，密度梯度离心法常规分离PBMC，细胞计数至少达到5.0×106个/ml。 　　1.3.2 RNA的提取：细胞中加入750 μl RNAiso plus，室温静置5 min，12 000 r/min离心5 min，上清移至新的离心管，加入1/5RNAiso plus体积量的氯仿，室温静置5 min，12 000 r/min离心15 min，上清移至新的离心管，加入等体积量的异丙醇，室温静置10 min，12 000 r/min离心10 min，向沉淀中加入1 ml的75%乙醇，弃上清保留沉淀，溶于20 μl DEPC处理水中。 　　1.3.3 根据Genbank人BAFF mRNA序列（AF132600），利用PCGENE软件设计引物（表1）。 　　1.3.4 反转录反应：加入5×PrimeScriptBRBuffer 4 μl，PrimeScriptBRRT Enzyme MixⅠ1 μl，Oligo Dt Primer 1 μl，Random 6 mers 1 μl，Total RNA 5 μl，DEPC处理水8 μl。37℃15 min，