稻粒黑粉病稻曲病恶苗病病原真菌MALDI―TOF―MS鉴定规范化条件研究.docVIP

稻粒黑粉病稻曲病恶苗病病原真菌MALDI―TOF―MS鉴定规范化条件研究 　　摘要：采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，简称MALDI-TOF-MS）技术对水稻作物的3种主要病原真菌进行分析，以获得稳定的指纹图谱。从菌物预处理方法、基质、点样方法等3个方面进行比较，对影响MALDI-TOF-MS分析结果的主要因素进行优化。结果表明，菌物预处理方法对检测结果的影响最大，热处理法在细胞壁较厚的真菌样品处理中可以获得较完整的生物信息；构建稻粒黑粉病病菌（Tilletia horrida）、稻曲病病菌（Ustilaginoidea virens）、恶苗病病菌（Fusarium moniliforme）的MALDI-TOF-MS鉴定规范化方法，扩充MALDI-TOF-MS指纹图谱数据库，可简便、快速、准确地对细胞壁加厚的真菌样品进行鉴定。 　　关键词：MALDI-TOF-MS；稻粒黑粉病；稻曲病；恶苗病；鉴定；指纹图谱 　　中图分类号： S435.111.4文献标志码： A文章编号：1002-1302（2017）23-0093-07 　　水稻真菌病害大多是由病原菌的分生孢子、厚垣孢子以种子、土壤带菌或空气水流传播的方式流行[1]。近年来由于新型超级稻的推广，稻粒黑粉病、稻曲病、恶苗病的真菌病害逐渐上升为水稻的主要病害。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，简称MALDI-TOF-MS）技术可借助基质对非挥发性和热不稳定性等生物大分子进行解吸电离，脉冲激发后离子云电离粒子真空向上通过飞行管探测器，产生1个频谱图被认为是该微生物的指纹图谱[2]。 　　植物病原真菌各生长阶段营养体差异较大，表达的蛋白种类和表达量有一定变化，与细菌相比，真菌孢子细胞壁含多糖和固醇类物质，在MALDI-TOF-MS鉴定中没有单一的方法被作为常规处理方法使用，其结果常出现因培养条件不同而导致鉴定结果不准确的情况[3-5]。基于DNA序列的鉴定方法受PCR引物探针特异性、测序成本和时间等因素的制约。本研究对稻粒黑粉病病菌（Tilletia horrida）、稻曲病病毒（Ustilaginoidea virens）和恶苗病病菌（Fusarium moniliforme）的MALDI-TOF-MS鉴定从预处理方法、适用基质、点样方法等3个方面进行优化[1，6]，对病原真菌建立标准规范化的 MALDI-TOF-MS鉴定方法并进行稳定性重复分析，为植物病原真菌的MALDI-TOF-MS鉴定方法提供参考。 　　1材料与方法 　　1.1试验材料 　　试验所用菌种分离自水稻带菌种子中，由安徽出入境检验检疫局植物检疫实验室保存。 　　PDA培养基：200 g马铃薯、20 g葡萄糖、18 g琼脂，加入1 000 mL蒸馏水中加热搅拌溶解，灭菌后待冷却至55～60 ℃倒平板。 　　察氏培养基：3.00 g硝酸钠、1.00 g磷酸氢二钾、0.50 g硫酸镁、0.50 g氯化钾、0.01 g硫酸亚铁、30.00 g蔗糖、18.00 g 琼脂，加入 1 000 mL 蒸馏水中加热搅拌溶解，灭菌后待冷却至55～60 ℃ 倒平板。 　　基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析系统，购自日本岛津公司。 　　1.2试验方法 　　1.2.1MALDI-TOF-MS参数线性操作模式，延迟提取，分析离子带正电荷，基质抑制偏转模式，加速电压为20 kV，提取电压为18.6 kV，脉冲离子提取时间为3 500 ns，质荷比范围为1 500～20 000，激光?c击数为每张图谱80～100次，激光频率60.0 Hz。使用大肠杆菌ATCC 8739作为外标校准物质。 　　1.2.2病原真菌的培养稻曲病病菌的培养：将纯化保存的菌株接种于PDA平板中，28 ℃活化培养7 d。 　　恶苗病病菌的培养：将纯化保存的菌株接种于察氏培养基平板中，28 ℃活化培养7 d。 　　稻粒黑粉病病菌厚垣孢子的获得：病粒在75%乙醇中浸泡5 min后夹出，在滤纸上晾干，再用无菌水漂洗病粒2次，夹出病粒用滤纸吸干水分，用刀切开病粒将厚垣孢子抖入装有无菌水的培养皿中，用擦镜纸过滤得到稻粒黑粉病菌的厚垣孢子。 　　1.2.3样品的预处理方法选择用接种针各挑取20 mg（湿质量）稻曲病病菌、恶苗病病菌菌体和稻粒黑粉病病菌厚垣孢子，采用75%乙醇法、热处理法、液氮研磨法、载玻片挤压法、氧化锆珠匀浆法等5种方法分别对