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茄病镰孢菌对铁皮石斛致病性研究 　　摘要：研究茄病镰孢菌（Fusarium solani）对铁皮石斛（Dendrobium officinale）的致病性。试验组通过穿刺接种将茄病镰孢菌菌悬液接种于铁皮石斛组培苗及成苗的根部和叶片，植物发病后从病变植株中分离致病菌，并结合形态和分子生物学方法进行鉴定。正常对照组接种无菌水。对照组的铁皮石斛正常生长，试验组的铁皮石斛发生不同程度的病变，病原菌经形态和分子生物学鉴定显示为茄病镰孢菌。茄病镰孢菌对铁皮石斛有致病性。 　　关键词：茄病镰孢菌（Fusarium solani）； 铁皮石斛（Dendrobium officinale）； 致病性 　　中图分类号：S432.4+4 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）06-1441-04 　　DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2016.06.019 　　茄病镰孢菌（Fusarium solani）隶属真菌界半知菌类子囊菌门镰刀菌属，是一种广泛分布的植物病原菌[1，2]，如茄子根腐病[3]、百合枯萎病[4]、薯干腐病[5]、大豆猝死症[6]等均由茄病镰孢菌感染引起。该病原菌主要通过伤口感染植物，植物病株表现为叶片萎缩、发黄，根部软腐，严重的萎蔫枯死，是寄生能力和致病力都较强的土传病菌[3]。茄病镰孢菌也是草坪病害的主要病原菌[7]，同时还会引起人类真菌性角膜病[8]。 　　铁皮石斛（Dendrobium officinale）是兰科石斛属多年生附生草本植物，具有很高的药用价值和观赏价值，深受人们的喜爱。野生铁皮石斛远不能满足市场需求，因此铁皮石斛的人工栽培应运而生并实现了大规模种植，但铁皮石斛在移栽两年前后容易发病，若在栽培环节失误，将对铁皮石斛的产量和药材质量造成严重影响，从而造成较大的经济损失[9，10]。加强铁皮石斛病害的防治，是人工种植铁皮石斛非常重要的环节。真菌病是铁皮石斛的主要病害之一，目前相关研究表明棕榈疫霉菌（Phytophthora palmivora）、灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）、尖孢镰刀菌（F. oxysporum）和串珠镰刀菌（F. moniliforme）可引起铁皮石斛的炭疽病、黑腐病、枯萎病、花枯病等真菌病害[11-15]，但关于茄病镰孢菌是否是铁皮石斛的真菌病害病原菌，尚未见报道。本研究采用人工感染的方法探究茄病镰孢菌对铁皮石斛的致病性，以期为铁皮石斛病害的防治提供理论依据。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　铁皮石斛组培苗由大理大学农学与生物科学学院组培室提供。铁皮石斛成苗购于大理市银桥镇铁皮石斛栽培基地，按每盆2～3株移植后置于室内，室温自然光照条件下培养30 d。茄病镰孢菌分离自大理白族自治州祥云县大波那温泉，中国科学院微生物研究所鉴定，大理大学农学与生物科学学院微生物实验室保存并提供。 　　1.2 培养基的配制 　　马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基的配制参照文献[16]进行。铁皮石斛分瓶生根培养基的配制参照文献[17，18]进行。 　　1.3 铁皮石斛组培苗生根培养 　　在无菌条件下对未生根的铁皮石斛组培苗进行分瓶。接好后置于26 ℃恒温培养箱中光照培养，待长出完整叶片和根后，在室温、自然光照条件下培养15 d可进行感染试验。 　　1.4 茄病镰孢菌菌悬液的制备 　　茄病镰孢菌在PDA培养基暗培养3 d，用无菌水漂洗菌落表面，制成孢子悬浮液[19]。 　　1.5 茄病镰孢菌感染试验 　　1.5.1 铁皮石斛组培苗感染试验 取铁皮石斛组培苗10瓶，随机分为A、B两组，每组5瓶，A组为试验组，B组为对照组。在无菌条件下，分别量取5 mL孢子悬浮液穿刺接种于A组组培苗的根部和叶片，对照组接种无菌水。将A、B两组置于室温、自然光照条件下隔离培养，定期观察并记录铁皮石斛的生长状况。 　　1.5.2 铁皮石斛成苗感染试验 取铁皮石斛成苗10盆，随机分为C、D两组，每组5盆，C组为试验组，D组为对照组。分别量取5 mL孢子悬浮液穿刺接种于C组成苗的根部和叶片，对照组接种无菌水。将C、D两组置于室温、自然光照条件下隔离培养，定期观察并记录铁皮石斛的生长状况。 　　1.6 病原菌的分离纯化 　　参照文献[20，21]对病变植株进行病原菌分离纯化培养。 　　1.7 病原菌的形态鉴定 　　单孢分离纯化培养物接种于PDA平板上，参照相关文献进行镜检[22]，观察气生菌丝、孢子梗和分生孢子等的形态特征，依据相关文献[1-3，23]进行形态学鉴定。 　　1.8 病原菌的分子生物学鉴定 　　1.8.1 病原菌DNA提取及凝胶电泳 对组培苗和成苗中分离纯化后得到的菌落（编号分别为1、2）采用改良的CTAB裂解法提取病