莱克多巴胺ELISA间接非竞争检测方法建立.docVIP

莱克多巴胺ELISA间接非竞争检测方法建立 　　摘要：本快速测定方法使用甲醇提取液超声波提取动物源性制品中莱克多巴胺，采用样品与抗体预混的间接非竞争法测定样品中的莱克多巴胺。没有采用常规的间接竞争法，而是预先混合抗体和待测物质，使得检出限底，达到0.0044ng/mL，其含量在0.0044～11ng/mL浓度范围内呈良好线性关系，相关系数R2=0.9799，回收率在65%～89%之间，具有较好的稳定性、重现性和回收率，能满足实验室的检测要求。 　　关键词：ELISA 莱克多巴胺 间接非竞争法 低检出限 　　中图分类号：S859.8 文献标识码：A 文章编号：1672-5336（2014）02-0015-06 　　1 材料与实验方法建立 　　1.1 试剂 　　莱克多巴胺人工偶联牛血清白蛋白抗原（RAC-BSA），莱克多巴胺小鼠单克隆抗体，辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠二抗，牛血清白蛋白（BSA），均由北京奥博森提供。磷酸二氢钾，十二水合磷酸氢二钠，氯化钠，氯化钾，碳酸钠，碳酸氢钠，一水合柠檬酸，吐温-20，二甲基亚砜，30%双氧水，硫酸，以上试剂均为国产分析纯试剂。 　　试剂配制： 　　精确称取氯化钠4.0000g、十二水合磷酸氢二钠 1.4500g、氯化钾0.1000g和磷酸二氢钾0.1000g，混合后用超纯水溶解并定容至500mL，得到磷酸盐缓冲液（PBS），该磷酸盐缓冲液的pH值为7.4，磷酸盐缓冲液过0.22μm微孔滤膜除菌，并保存在4℃下。 　　精确称取碳酸钠0.3975g和碳酸氢钠0.7425g，混合后用超纯水溶解并定容至500mL，得到碳酸盐缓冲液（CBS），该碳酸盐缓冲液的pH值为9.6，碳酸盐缓冲液过0.22μm微孔滤膜除菌，并保存在4℃下。 　　精确称取一水合柠檬酸2.5514g和十二水合磷酸氢二钠9.1951g，混合后用超纯水溶解并定容至500mL，得到底物缓冲液，该底物缓冲液的pH值为5.0，底物缓冲液过0.22μm微孔滤膜除菌，并保存在4℃下。 　　精确称取牛血清白蛋白（BSA）1g，用PBS定容至100mL，得到BSA封闭液，BSA封闭液过0.22μm微孔滤膜除菌，并保存在4℃下。 　　取500ml PBS溶液，加入250μL吐温-20，得到PBST洗液，PBST洗液过0.22μm微孔滤膜除菌，并保存在4℃下。 　　精确称取3，3’，5，5’-四甲基联苯胺（TMB） 0.0100g，溶于2mL二甲基亚砜中，得到TMB底物液，TMB底物液过0.22μm微孔滤膜除菌，并保存在4℃下。 　　分别取质量百分比浓度为10%的双氧水溶液21μL、底物缓冲液10mL和TMB底物液200μL，临用前混合，得到显色液。 　　称取98g浓硫酸，缓慢倒入200mL蒸馏水中，冷却至室温定容至500mL，得到2mol/L的硫酸终止液。 　　称取氯化钠2g，用蒸馏水溶解并定容至100mL，得到2%氯化钠。 　　吸取浓盐酸2mL，用蒸馏水溶解并定容至100mL，得到2%（V/V）盐酸。 　　按体积比2%氯化钠：2%盐酸：甲醇=1：1：8混合，得到样品酸性提取液。 　　1.2 仪器 　　恒温干燥箱，酶标仪，4℃冰箱。 　　1.3 实验方法建立 　　（1）酶标板吸附能力均一性检测：见表1 　　若酶标板每个孔内活性位点不均匀，会导致实验结果差异，平行不好，所以首先检查所使用的酶标板的均一性。随机选取六块酶标板，每块酶标板再随机选择四个酶标孔，以CBS为缓冲液将抗原蛋白稀释到2μg/mL，并加入到酶标孔内，每孔加入100μL，加盖放入4℃冰箱孵育24h（以上步骤称为包被），倒出孔内液体，甩干，向每个酶标孔内加入300μLPBST洗涤液，震荡摇匀，倒出孔内液体，甩干，重复洗涤四次，拍干（以上步骤称为洗板），拍干后向每个酶标孔内加入 300μLBSA封闭液，并放入37℃恒温箱中孵育90min（该过程称为封闭）；封闭结束后，重复洗板过程，以PBS缓冲液将抗体蛋白稀释到1μg/mL，并加入到酶标孔内，每孔加入100μL，并放入37℃恒温箱中孵育20min，反应结束后重复洗板过程，以PBS为缓冲液将酶标二抗稀释到1μg/mL，并加入到酶标孔内，每孔加入100μL，并放入37℃恒温箱中孵育20min，反应结束后重复洗板过程，拍干后向孔内加入显色液100μL/孔，放入37℃恒温箱中孵育15min，充分显色。反应结束后向孔内加入终止液50μL/孔，轻轻振荡混匀，酶标仪波长设定为450nm，在5min之内测定每孔的吸光值，同时作空白实验，以空白作参比；（整个过程称为间接ELISA试验）。 　　根据吸光值可知其中一块酶标板不合实验要求，之后实验中不能使用。其他五块酶标板板间变异系数小于10%符合ELISA实验的要