半滑舌鳎抗病相关snp标记的筛选及两种免疫相关基因的克隆与初步分析-动物遗传育种与繁殖专业论文.docxVIP

问斗蝉tH 。 飞、 。 0 多 向川 立斗 万方数据 上海海洋大学硕士学位论文 答辩委员会成员名单 姓名 工作单位 职称 备注 中国海洋大学 教授 主席 中国海洋大学 教授 王.::::;a:二 5E3 中国海洋大学 教授 当.::::;a:乏二 5E2 中科院沟洋所 研究员 王=ξL 5E=卫1 中科院海洋所 研究员 去.::::;ξa:二5E=1 江节r 中国水产科学研究院 | 副研究员 | 秘书 黄沟水产研究所 」一 lJE辩地点 黄海水产研究所 !答辩日期 上海海洋大学硕士学位论文 半滑舌鳎抗病相关 SNP 标记的筛选及两种免疫 相关基因的克隆与初步分析 摘 要 半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis）是我国特有的名贵海水养殖鱼类，其味道 鲜美、口感爽滑、营养丰富，深受广大消费者喜爱，极具市场经济价值和养殖开 发潜力。然而，高密度、集约化的养殖模式以及环境污染等原因，致使半滑舌鳎 腹水、烂鳍、烂尾等细菌性疾病日益突出，严重制约了半滑舌鳎工厂化养殖产业 的发展。将传统选择育种模式与分子标记辅助选择育种技术相结合，有利于半滑 舌鳎抗性品系的培育，单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphisms, SNP） 被认为是一种极具应用前景的分子标记技术。本文以半滑舌鳎为研究材料，克隆 了半滑舌鳎两种免疫相关基因 Nramp 和 IL-10，并进行了初步分析研究；利用直接 测序法筛选了 Nramp 基因抗病相关的 SNP 分子标记，以期为半滑舌鳎抗性品系培 育提供技术支持。主要研究结果如下： 1. 半滑舌鳎免疫相关基因的克隆与初步分析研究 利用 cDNA 末端快速扩增技术，对半滑舌鳎天然抗性相关巨噬细胞蛋白 （ Natural resistance associated macrophage protein, Nramp ） 和 白 细 胞 介 素 10 （Interleukin 10, IL-10）基因分别进行了克隆，并对其序列结构进行了分析研究。 随后，对半滑舌鳎 Nramp 和 IL-10 基因感染哈维氏弧菌前后转录组水平的表达分 析进行研究；并对半滑舌鳎 IL-10 基因原核表达进行了初步探索。 1）半滑舌鳎 Nramp 基因克隆与表达分析 Nramp 属于膜整合转运蛋白，具有抑制胞内寄生菌侵染、调节巨噬细胞抗菌 活性等作用。本研究克隆了半滑舌鳎 Nramp 基因的 cDNA 序列，该基因全长 3717 bp，具有 16 个外显子，其中开放阅读框（open reading frame, ORF）为 1677 bp， 所编码蛋白含有 558 个氨基酸，该蛋白具有 Nramp 家族的典型特征：包括 10 个跨 膜区（transmembrane, TM）、1 个由 20 个氨基酸残基组成的胞质内转运蛋白特征结 构域（consensus transport motif, CTM）。半滑舌鳎 Nramp 基因其 ORF 末端有 1 个 I  类似于脊椎动物 Nramp2 中 的 铁 反 应 控 制 蛋 白 结 合 位 点 （ iron-responsive regulatory-protein-binding sites, IRE）。半滑舌鳎 Nramp 与其他 14 个物种的 Nramp 氨基酸序列同源性在 63~91%之间，系统进化分析表明，半滑舌鳎 Nramp 和所有鱼 类 Nramp 聚集为一簇，与其他物种 Nramp2 的亲缘关系较近。实时荧光定量 PCR 分析表明，Nramp 基因在半滑舌鳎脾脏和肾脏中的表达量最高，而在肌肉和性腺 中的表达量最低；在哈维氏弧菌感染后的半滑舌鳎肾脏、脾脏和肝脏中表达量呈 升高趋势，而在鳃中则表现为下调趋势。 2）半滑舌鳎 IL-10 基因克隆与原核表达 IL-10 是一种具有广泛作用的细胞因子，其主要功能是抑制和终止炎症反应。 本研究克隆了半滑舌鳎 IL-10 基因的 cDNA 序列，该基因全长 935 bp，具有 5 个外 显子，其 ORF 为 561 bp，所编码蛋白含有 186 个氨基酸，包含 4 个保守的半胱氨 酸残基构成 2 对 二 硫 键 ， 该蛋白 具 有 IL-10 家族的特征序列 ： G-X2-KA-X2-[D,E]-X-D-[ILV]-[FLV]-[FILMV]-X2-[ILMV][EKQR]。半滑舌鳎 IL-10 与其他 15 个物种的 IL-10 氨基酸序列同源性在 27~62%之间，系统进化分析表明， 半滑舌鳎 IL-10 与红鳍东方鲀、大西洋鳕、欧洲鲈鱼和青斑河豚的亲缘关系最近， 聚集为一支；而在高等动物中与原鸡的亲缘关系最近。实时荧光定量 PCR 分析表 明，半滑舌鳎 IL-10