半滑舌鳎生长轴关键基因的重组表达及对生长与生殖的调控机制分析-水产养殖专业论文.docxVIP

上海海洋大学硕士学位论文 II 利用 PCR 方法将扩增片段克隆到原核表达载体 pET-28a 上，得到重组 质粒，将重组质粒导入到大肠杆菌 BL21(DE3)后经 IPTG 诱导产生 N 端含 6 个组氨酸的融合蛋白。以 SDS电泳检测和 SigmaScan 软 件分析获得的蛋白，结果表明：IGF-Ⅰ融合蛋白大小为 11.4KD，在 37℃ 条件下 IPTG 诱导 3h 时目的蛋白表达量最高，占细菌总蛋白的 58.5%， 融合蛋白主要以包涵体形式存在。IGF-Ⅱ融合蛋白大小也为 11.4KD， 在 IPTG 诱导 2h 时目的蛋白表达量最高，占细菌总蛋白的 43.7%。利 用 Western blotting 方法验证这两种融合蛋白均可特异性的被 6×His 抗 体识别。诱导表达蛋白后的菌液沉淀经 6mol/L 盐酸胍变性、Ni2+离子 亲和柱纯化和尿素梯度复性，获得大小为 11.4KD 的纯化蛋白。细胞增 殖实验表明，本研究所得 IGF-Ⅰ和 IGF-Ⅱ融合蛋白能显著促进人乳腺 癌细胞 MDA231 细胞的增殖，具有明显的生物学活性。 根据半滑舌??生长激素（GH）基因的 cDNA 全长序列，分析并设 计引物克隆得到编码 GH 的成熟肽序列，此序列由 552 个碱基组成。 利用 PCR 方法将扩增片段克隆到原核表达载体 pET-28a 上，得到重组 质粒，将重组质粒导入到大肠杆菌 BL21(DE3)后经 IPTG 诱导产生 N 端含 6 个组氨酸的融合蛋白。SDS电泳检测和 SigmaScan 软件 分析表明：GH 融合蛋白大小为 26KD，在 IPTG 诱导 4h 时目的蛋白表 达量最高，占细菌总蛋白的 41.5%，主要以包涵体形式存在。利用 Western blotting 方法验证 GH 融合蛋白可特异性的被 6×His 抗体识别。 诱导表达后的菌液沉淀经纯化和复性后，获得大小为 26KD 的纯化蛋 III 白。纯化后的 GH 融合蛋白稀释后以 ELISA 方法测定分析，结果显示 本研究获得的半滑舌鳎 GH 融合蛋白具有抗原活性。细胞增殖试验发 现 较 高 浓 度 的 重组 半 滑 舌 鳎 GH 在 体 外 具 有 抑 制 人 乳 腺 癌 细 胞 MDA231 细胞增殖的特性，表明其可能具有生物学活性。 2．重组 GH 和 IGF-I 对半滑舌鳎幼鱼生长的影响及机制研究 利用注射诱导方法认识了外源重组牛 GH 和重组半滑舌鳎 IGF-I 对半滑舌鳎幼鱼生长的影响，并从血清生长相关激素水平和消化酶角 度分析了其可能的机制。结果表明：10μg/尾的外源重组牛 GH 可促进 半滑舌鳎的生长，体重增重率比对照组高 28.38%；2.5μg/尾和 25μg/尾 的重组半滑舌鳎 IGF-I 可显著促进半滑舌鳎生长，体重增重率比对照组 分别高 35.75%和 50.91%（P＜0.05）。快速生长的试验鱼饵料转化效 率升高，肠道蛋白酶和淀粉酶活力升高，但血清中 GH 和 IGF-I 表达水 平变化不明显。这些结果表明外源 GH 或 IGF-I 可促进养殖半滑舌鳎的 生长，其可能主要是通过提高试验鱼的饵料转化效率和消化酶活力实 现的。本研究结果为深入认识半滑舌鳎生长轴（GH/IGF-I axis）的调控 作用机制和建立实用的半滑舌鳎养殖生长调控技术提供了基础资料。 3. 半滑舌鳎 GH 与 IGF-I 对卵巢发育的调控作用及机制研究 利用组织切片技术将半滑舌鳎卵巢发育划分为Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、 Ⅵ 5 个时期，采用荧光实时定量 PCR 方法检测在卵巢发育的不同时期 半滑舌鳎垂体 GH 和脑、垂体、性腺、肝脏 IGF-I 基因 mRNA 的表达 水平变化，并利用酶联免疫吸附测定（ELISA）方法研究了半滑舌鳎血  PAGE 6 清中 GH 和 IGF-I 的表达水平变化。结果表明：随卵巢的发育垂体 GH mRNA 表达水平水平逐渐升高，在产卵期（Ⅴ期）达峰值（P＜0.05）， 在产卵结束后迅速下降（P＜0.05）。肝脏 IGF-I mRNA 表达水平自Ⅱ 期开始缓慢下降并在Ⅳ期达到最低水平（P＜0.05），在产卵期（V 期） 又开始缓慢升高，当产卵结束后（Ⅵ期）迅速上升达到最高水平（P＜ 0.05）。卵巢 IGF-I mRNA 表达水平自Ⅱ期开始显著升高（P＜0.05） 并在Ⅳ期达峰值（P＜0.05），在 V 期明显降低（P＜0.05）并保持至 产卵结束后的Ⅵ期。垂体 IGF-I mRNA 表达水平在Ⅲ期明显升高（P＜ 0.05），但其后下降至Ⅱ期水平，但在产卵结束后的Ⅵ期迅速升高至较 高水平（P＜0.05）。脑中 IGF-I mRNA 表达水平自Ⅲ期开始显著升高 （P＜0.05）并在 V 期时达峰值（P＜0.05）。 卵巢发育