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菠萝微卫星指纹图谱构建 　　摘要：初步构建了菠萝种质的SSR指纹图谱，为菠萝种质鉴定提供了依据。从菠萝EST－SSR开发的20对微卫星引物扩增31份不同的菠萝种质，筛选出能够稳定扩增且带型差异明显的SSR引物。挑选5对多态性高、分辨率高、重复性好的SSR引物对，作为标准引物对材料进行扩增。每对引物得到的多态性带数8－15个，平均为11条；引物的多态信息含量(PIC)在0.6437-0.7928，平均0.7373。依据带型特征，建立菠萝DNA分子指纹图谱。 　　关键词：菠萝；SSR；指纹图谱 　　中图分类号：S668.3　文献标识码：A　文章编号；1009-9980(2011)02-240-06 　　 　　菠萝属菠萝科、凤梨属，原产南美洲巴西和巴拉圭，在热带和亚热带地区均有分布。菠萝最早由印第安人传至中南美洲和西印度群岛，自哥伦布从瓜德罗普岛带至西班牙之后，在世界各地推广，覆盖全球70多个国家和地区。菠萝在热带水果生产和贸易中的地位仅次于香蕉和芒果，是中南美洲和亚太地区的重要经济作物之一。 　　在菠萝的栽培及传播过程中，由于传播者及当地栽培者的习惯命名不同，各品种的别名特别多，出现了异名或多名的现象，造成了菠萝品种名称混乱的现象，而且各大类群品种的变异性大，这不但阻碍了菠萝种质资源的合理利用，也影响了菠萝的品种改良与育种。 　　DNA指纹图谱是指建立在DNA标记基础上的某一品种所具有的区别于其他品种的特异DNA片段。DNA分子标记绘制的品种指纹图谱像人的指纹一样具有个体特异性，能准确、快速鉴定品种或品系，简化了作物育种和种子管理工作。通过图谱可表现与目标性状有关的DNA水平的信息，避免了环境干扰；不受生长发育时间的制约；准确可靠；特别适合从形态上较难鉴定的品种。通过检测待测样品是否具有目标品种特有的指纹片段及其比例，可以有效地鉴定种子的纯度、品种的真伪，对种子质量进行监测。另外，通过DNA指纹的比较可以方便地提供分子水平的直接证据，有利于品种或材料获得专利保护。 　　微卫星分子标记是近些年发展起来的建立在PCR扩增基础上的分子遗传标记，已被广泛用于玉米、水稻、大豆、小麦等农作物DNA指纹图谱的构建及杂交种子纯度鉴定研究中。国内外有利用AFLP、ISSR、RAPD、RFLP等分子标记技术对菠萝进行研究的报道，但SSR分子标记技术的应用鲜见报道。 　　我们利用自主开发的5对SSR引物构建了31份菠萝种质的SSR指纹图谱，初步建立了一套适用于菠萝种质鉴定的SSR技术体系，旨在为菠萝新品种的登记、分类和保护奠定分子基础。 　　 　　1、材料和方法 　　 　　1.1材料 　　材料来源于中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所和中国热带农业科学院南亚热带作物研究所，菠萝种质圃所保存的种质(表1)。取田间生长健壮、无病虫危害植株的幼嫩叶片，保存于-70℃备用。 　　1.2 DNA提取 　　DNA提取采用改良的CTAB法，程序简介如下：取约1g样品，在液氮中研磨成粉末；加5mLCTAB提取缓冲液[100mmol?L-1Tris-HCl(pH8.0)，5mmol?L2--1EDTA-Na2，0.35mol?L-1葡萄糖，2％PVP40，用前加入3％β-巯基乙醇]，离心后弃去上清；加入5mL65℃预热CTAB裂解缓冲液[100mmol?L-1。Tris-HCl(pH8.0)，20mmol?L-1EDTA-Na2，1.4mol?L-1NaCl，2％CTAB，2％PVP40，用前加入3％3-巯基乙醇]，摇匀，65℃水浴30-90min；加等体积氯仿：异戊醇(24：1)抽提；上清液用0.6倍体积的异丙醇和1/10体积3mol?L-1乙酸钠(pH5.2)沉淀DNA；用无离子水稀释DNA之后用酚：氯仿：异戊醇(体积比为25：24：1)和氯仿：异戊醇(体积比为24：1)抽提纯化；最后用2倍体积预冷无水乙醇沉淀DNA，用TE溶解。所有沉淀都经70％乙醇清洗2-3次。 　　1.3PCR扩增和电泳检测 　　PCR扩增反应体系的总体积为20μL包括：2μL的10×PCR buffer，1.6μL的1.5mmol?L-1MgCl2，0.25mmol?L-1dNTPs，5pmol正、反向引物各1μL，20ng模板DNA，0.15U Tag(5U?μL-1)；反应程序为：94℃预变性3min，30个循环(94℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸1min)，72℃延伸7min。PCR产物的分离用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，1×TBE电泳缓冲液120V恒压电泳1.5h，电泳完毕采用银染显色、检测。观察并照相记录。 　　1.4指纹图谱的构建 　　借鉴小麦带型记录的新方法，根据每对SSR引物生成带型间的差别直接对带型进行分类编号，可