荜茇总生物碱对6―羟基多巴胺致帕金森病大鼠多巴胺能神经元损伤保护作用研究.docVIP

荜茇总生物碱对6―羟基多巴胺致帕金森病大鼠多巴胺能神经元损伤保护作用研究 　　[摘要] 目的：探讨荜茇总生物碱（PLA）对6-羟基多巴胺（6-OHDA）致帕金森病（PD）大鼠多巴胺能神经元损伤的保护作用及其可能的机制。方法：采用脑立体定位单侧纹状体注射6-OHDA建立大鼠PD模型，将PD大鼠随机分为PLA组（PLA 50 mg?kg-1?d-1），美多巴组（美多巴50 mg?kg-1?d-1）及模型组，每组15只，每日灌胃给药1次，连续6周。另随机选取15只大鼠在纹状体仅注射生理盐水作为假手术组。采用阿朴吗啡（APO）诱导的大鼠旋转及转棒实验进行行为学观察，酪氨酸羟化酶（TH）免疫组化检测大鼠黑质中TH阳性细胞数及纹状体中TH阳性纤维密度，用分光光度法检测大鼠黑质及纹状体内超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、还原型谷胱甘肽（GSH）、过氧化氢酶（CAT）、丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）及一氧化氮合酶（NOS）的含量。结果：帕金森病大鼠在APO诱导后出现明显的旋转行为，且在转棒上的滞留时间缩短，黑质区TH阳性细胞数及纹状体TH阳性纤维密度明显减少，组织内SOD，GSH-Px，CAT的活力降低，NOS的活力升高，MDA，NO含量升高，GSH含量降低，总抗氧化能力明显降低。PLA能明显改善PD大鼠的行为学异常，增加黑质区TH阳性细胞数及纹状体TH阳性纤维密度，提高组织内SOD，GSH-Px，CAT的活力，降低NOS的活力，降低MDA和NO含量，提高GSH含量，总抗氧化能力明显提高。结论：荜茇总生物碱对6-OHDA致PD模型大鼠的黑质细胞具有保护作用，其机制可能与抗氧化活性有关。 　　[关键词]帕金森病； 荜茇； 生物碱； 6-羟基多巴胺； 抗氧化 　　帕金森病（Parkinson′s disease，PD）是一种神经系统退行性疾病，其病理特征为黑质和纹状体多巴胺（dopamine，DA）能神经元变性缺失、纹状体DA 含量显著减少[1]。目前临床上常用左旋多巴类药物治疗PD，该类药物只能改善PD的临床症状，无法从根本上控制和阻断PD的进程。并且随着病程不断增长和用药量的加大，所显现出来的副作用也越来越明显。因此，寻找疗效确切且副作用小的药物成为研究PD药物的热点。 　　荜茇Piper longum L.是中蒙藏维医习用药材，具有温中散寒，行气止痛等功效，在印度也广泛应用[2]。荜茇中含有较丰富的酰胺类生物碱，并且具有抗炎、抗氧化、抗乙肝病毒和免疫调节等广泛的药理活性[3-4]。近年来的研究表明，荜茇中含量最高的胡椒碱具有很强的抗氧化作用，可以通过抑制线粒体膜通透性的改变减少MPP+诱导PC12细胞的凋亡[5]，并且对6-羟基多巴胺（6-OHDA）诱导的PD大鼠具有神经保护作用，推测可能是通过抗凋亡和抗炎机制发挥神经保护作用[6]。本课题组在前期研究工作中，已建立了荜茇总生物碱（PLA）有效部位提取制备的稳定工艺[7]，并对荜茇总生物碱的化学成分及其在大鼠体内的药代动力学和组织分布进行了研究[8-10]，为荜茇总生物碱的药效研究奠定了基础。本研究以6-OHDA单侧损伤纹状体制备PD大鼠模型，探讨荜茇总生物碱对损伤神经元的保护作用及其对氧化应激反应的影响，为开发荜茇防治帕金森病提供初步的实验依据。 　　1材料与方法 　　1.1试剂 6-羟基多巴胺（6-OHDA，美国Sigma公司，批号MKBH3054）；阿朴吗啡（apomorphine，APO，美国Sigma公司，批号 SLBB0077V）；美多巴（上海罗氏有限公司，批号SH1001）；酪氨酸羟化酶单克隆抗体（美国Sigma公司，批号101M4796）；鼠ABC检测试剂盒（美国Vector公司，批号172013）；浓缩型DAB试剂盒（北京中衫金桥生物技术有限公司，批号K133319D）；总蛋白定量测试盒（批号，超氧化物歧化酶（SOD）测试盒（批号，丙二醛（MDA）测试盒（批号，还原型谷胱甘肽（GSH）测试盒（批号，谷胱甘肽-过氧化物酶（GSH-Px）测试盒（批号，一氧化氮（NO）测试盒（批号，一氧化氮合酶（NOS）测试盒（批均购自南京建成生物工程研究所。 　　1.2仪器 Stoelting脑立体定位仪（美国Stoelting公司）；大鼠旋转行为记录仪（美国Columbus Instruments公司）；大鼠疲劳转棒仪（西班牙Panlab公司）； CM 3050S冰冻切片机（德国Leica公司）；ECLIPSE80i型显微镜（日本Nikon公司）； SIGMA-3K15冷冻离心机（德国SIGMA公司）；SP