血清饥饿、汇合培养和放线菌酮对奶牛成纤维细胞周期影响.PDFVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００８，２８（１２）：５７～６１ 血清饥饿、汇合培养及放线菌酮对 奶牛成纤维细胞周期的影响 １ １ ２ ２ 施巧婷 　楚秋霞 　翁　凡 　徐照学 （１河南省农业科学院畜牧兽医研究所　郑州　４２０００２　２黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院　大庆　１６３３１９） 摘要　在动物克隆研究中，研究者普遍认为位于细胞周期的Ｇ ＋Ｇ期的二倍体细胞对于核移植 ０ １ 中供核细胞的重新程序化是必要的。探讨了血清饥饿、汇合培养及放线菌酮（ＣＨＸ）处理对不同 传代次数的体外培养奶牛成纤维细胞周期分布的影响。流式细胞仪分析结果显示：第３代和第 １３代细胞经血清饥饿处理７２ｈ后，细胞周期分布与对照差异显著（Ｐ＜０．０５）；汇合培养可以显著 增加奶牛成纤维细胞处于Ｇ ＋Ｇ期细胞数。ＣＨＸ处理第３代细胞经ＣＨＸ处理后处于Ｇ０＋Ｇ１ ０ １ 期的细胞数差异不显著，而第１３代细胞处理后差异显著。结果表明体外培养奶牛成纤维细胞高 代对血清饥饿、汇合培养及ＣＨＸ处理更敏感。 关键词　奶牛　血清饥饿　汇合培养　放线菌酮（ＣＨＸ）　流式细胞分析　细胞周期 中图分类号　Ｓ８１４．６ 　　在动物克隆研究中，研究者普遍认为核供体细胞 分子的合成作用受到抑制，使用浓度一般为１０ｇ／ｍｌ。 μ 与受体卵母细胞所处周期时相协调一致时更有利于核 本试验用３种同期化方法处理奶牛成纤维细胞，观察 供体细胞的重编程，调整核供体细胞所处周期时相是 其细胞周期变化，以期寻找到适合于核移植的供核同 提高核移植效率的有效措施之一。１９９７年 Ｗｉｌｍｕｔ 期化方法。 ［１］ 等 应用Ｇ期的乳腺上皮细胞获得了世界首例体细胞 ０ １　材料和方法 克隆动物———绵羊Ｄｏｌｌｙ，他们的一个重要贡献就是提 出了体细胞经血清饥饿后使核供体细胞周期时相处于 １．１　材　料 Ｇ ＋Ｇ期时再移入去核的处于Ｍ 期卵胞质中能够使 　　ＤＭＥＭＦ１２培养液购自美国ＧＩＢＣＯ公司、胎牛牛 ０ １ Ⅱ ? ［２～４］ 血清（ＦＢＳ）购自美国ＨｙＣｌｏｎｅ公司，胰蛋白酶、ＲＮＡ酶 重构胚获得较高的发育率。随后的许多研究 也都 证明了这一点。血清饥饿法是细胞同期化最常用的方 购自上海生工，其它药品试剂除标明外均购自美国 ［５］ Ｓｉｇｍａ公司，细胞培养器皿购自丹麦 Ｎｕｎｃ公司。流式 法 ，体外培养的细胞需要营养供给和有丝分裂原刺 激才能通过Ｇ Ｓ的关卡完成有丝分裂。细胞如缺少血 细胞仪为美国ＢＤ公司ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ ? １ 清则导致有丝分裂原和激素减少，代谢降低，引起蛋白 １．２　方　法 合成水平下降而停滞于Ｇ期。一些研究认为，体外培 １．２．１　牛成纤维细胞建系　成纤维细胞来自于河南 ０ 养的细胞处于汇合状态时可使其大部分处于 Ｇ ＋Ｇ 省农科院实验牛场２月龄奶牛。小牛绑定后，耳部边 ０ １ ［６，７］ 缘剃毛，酒精棉球消毒。用剪刀剪下 ２ 期 。放线菌酮（ｃｙｃｌｏｈｅｘｉｍｉｄｅ，ＣＨＸ）是一种