花叶型与艾叶型乌头叶片基因组DNA甲基化修饰MSAP分析.docVIP

花叶型与艾叶型乌头叶片基因组DNA甲基化修饰MSAP分析 　　[摘要] 建立乌头叶片DNA甲基化MSAP分析方法，并对不同形状的乌头叶片DNA甲基化修饰位点进行MSAP分析。以花叶型、艾叶型乌头不同部位叶片为实验材料，考察乌头叶片MSAP双酶切反应时间，筛选适宜的选择性扩增引物，并通过计算6%丙烯酰胺凝胶电泳图泳道和条带统计分析叶片甲基化修饰差异。结果150 ng乌头叶片DNA MSAP双酶切反应体系在37 ℃条件下，酶切16 h较充分；使用25对筛选出的适宜性引物进行乌头基因组的MSAP选择性扩增，总共获得273个电泳条带，其中无甲基化或单链内甲基化228条，双链内甲基化条带27条，单链外甲基化条带18条，总甲基化率达16.48%；花叶型与艾叶型乌头总甲基化率稍有差异，分别为15.36%，14.34%，并各自获得8条、6条基因组甲基化修饰差异的核苷酸片段，占其总条带数的3.00%，2.26%。通过研究可为乌头植株的分子鉴定、良种选育与栽培，以及乌头的遗传演化等提供新思路。 　　[关键词] 乌头； 叶型； 甲基化敏感性扩增多态性 　　乌头Aconitum carmichaeli Debx.为毛茛科乌头属植物，其子根加工品附子为常用中药，具有回阳救逆、补火助阳、散寒除湿的功效，可用于风寒温痹、关节疼痛、心腹冷痛、寒病作痛、麻醉止痛等[1]。目前我国的附子原药材基本实现基地规范化育种、栽培、采收与加工，产品行销韩、日及东南亚多国。 　　乌头具有多种形态学性状，以叶型差异为例，可分为南瓜叶、艾叶（油叶子）、丝瓜叶（莓叶子）、鹅掌叶、大花叶、小花叶、冒氏苗等类型。在传统道地产区江油，其附子规范化种植基地面积达千亩之广，主要栽培大花叶和艾叶（油叶子）2种叶型的乌头。在农业生产中，花叶型乌头品种的产量较艾叶型稍高，受到附农的偏爱，但艾叶型乌头的抗病性强，具有科学选育价值。花叶与艾叶型乌头栽培品，无论从传统分类学角度，还是从现代生物学的基因分子鉴定角度，都归属于乌头种之内；然而，同种之内的乌头植株之间，其叶片表现出形状差异的内在机制至今尚无研究。 　　表观遗传学（epigenetics）是目前研究植物外部形状差异与内在遗传基础关系的有力工具，是在DNA序列没有发生变异的情况下基因表达发生改变的可遗传改变[23]，是生物体应答环境变化（特别是逆境胁迫）的重要途径，尤其是调控植物外观形状发育的重要方式[4]。DNA甲基化是基因表观遗传修饰方式之一，正常植物体内均存在着一定水平和不同模式的甲基化DNA[5]，因此可通过甲基化修饰差异对不同物种或同一物种不同品系进行种质研究。 　　甲基化敏感扩增多态性（methylationsensitive amplified polymorphism， MSAP）是检测DNA甲基化的常用方法之一，利用HpaⅡ和MspⅠ 2个同裂酶对甲基化敏感程度不同，识别切割相同的酶切位点CCGG（真核生物中主要的甲基化位点）以判断该位点是否被甲基化修饰[6]，可在DNA序列未知的情况下对全基因组范围内胞嘧啶甲基化程度进行分析，并且能够检测DNA片段特异性位点甲基化的状态[7]。本实验建立并采用乌头叶片MSAP技术，对花叶型、艾叶型乌头的叶片DNA甲基化修饰程度进行对比检测，筛选两者差异性的基因片段，并分析讨论叶型表观的甲基化差异，为附子药材的分子鉴定、附子良种的选育与栽培、乌头的遗传演化等科研实践工作提供一定的借鉴价值。 　　1 材料 　　1.1 主要仪器 凝胶成像系统（美国BioRad， Gel DOCTM XR+）、PCR仪（BID RAD， T100TM Thermal Cycler 621BR13414）、凝胶水平电泳系统（BioRad Power PacTM Basic， MiniSubcellGT）、全自动样品快速研磨仪（上海净信科技， Tissuelyser48）、移液枪（Eppendorf ResearchR Plus， D130874Q）、微型离心机（SclloGEX， D1008E）、WH2 微型漩涡混合仪（上海泸西分析仪器有限公司）、立式压力蒸汽灭菌锅（日本HIRAYAMA， HVE50）、离心机（HITACHI CENTRIFUGE， CT15RE）。 　　1.2 主要试剂 DNA提取试剂盒（天根，CAT DP305）、琼脂糖（BIOWEST， 111860）、Trisbase（aMReSCO， 1674C019）、EDTA（Amresco）、GOLDVIEW（Wobisen Technoiogy）、丙烯酰胺（BIoSHARP）、甲叉双丙烯酰胺（Promega，SIGMA）、限制性内切酶Hpa Ⅱ（10 U?μL-1）（TaKaRa，、限制性内切酶MspⅠ（10