氨代谢双通路的恢复对hepg2细胞生物学功能的影响-临床检验诊断学专业论文.docxVIP

万方数据 万方数据 目 录 英文词缩略表………………………………………………………………（1） 中文摘要……………………………………………………………………（2） 英文摘要……………………………………………………………………（4） 前 言……………………………………………………………………（6） 材料与试剂…………………………………………………………………（8） 实验方法……………………………………………………………………（10） 结 果……………………………………………………………………（24） 讨 论……………………………………………………………………（49） 结 论……………………………………………………………………（53） 参考文献……………………………………………………………………（54） 综 述…………………………...….……………………………………（57） 综述参考文献………………………………………………………………（64） 在学期间获得的科研成果和发表的论文…………………………………（68） 致 谢……………………………………………………………………（69） 本课题受国家自然科学基金和福建省自然科学基金（2008J0087） 资助 英文词缩略表 缩略语 AFP 英文全称 alpha fetoprotein 中文全称 甲胎蛋白 BAL bioarti?cial liver 生物人工肝 hASL Arginosuccinate Lyase 人精氨酸琥珀酸裂解酶 hArgII human Arginase II 人精氨酸酶 II hASS Arginosuccinate Synthetase 人精氨酸琥珀酸合成酶 hCPSI Carbamoyl Phosphate Synthase I 人氨甲酰磷酸合成酶 I hArgI human Arginase I 人精氨酸酶 I hGS human glutamine synthetase 人谷氨酰胺合成酶 hOTC human Ornithine Transcarbamylase 人鸟氨酸转氨甲酰酶 DMSO dimethyl sulfoxide 二甲基亚砜 L-Gln L-Glutamine L-谷氨酰胺 L-Glu L-Glutamate L-谷氨酸 MeNH2 NH4Cl methylamine hydrochloride ammonium chloride 盐酸甲氨 氯化铵 CCK-8 Cell Counting Kit 8 细胞计数试剂盒 PCR polymerase chain reaction 聚合酶链反应 ALB albumin 白蛋白 TBIL total bilirubin 总胆红素 ALP alkaline phosphatase 碱性磷酸酶 γ-GT γ-glutamyltransferase γ-谷氨酰转移酶 LDH lactate dehydrogenase 乳酸脱氢酶 LD50 median lethal dose 半数致死量 1 氨代谢双通路的恢复对 HepG2 细胞生物学功能的影响 中文摘要 目的：HepG2 是一株永生化的人肝癌细胞株，已被用于生物人工肝系统的研究。 然而，降氨毒能力的不充分限制了它的进一步应用，原因是 HepG2 细胞中两条 氨代谢通路的谷氨酰胺合成酶(hGS)、精氨酸酶 I(hArgI)和鸟氨酸转氨酶(hOTC) 表达低下或缺失。在前期构建的过表达 hArgI 和 hOTC 的 HepG2/(hArgI+hOTC)4 细胞 的 基 础 上 ， 本研究 采用 携带 hGS 的 重组 逆 转 录 病 毒 感染 HepG2/(hArgI+hOTC)4 细胞的方法，试图恢复 HepG2 细胞的氨代谢双通路。 方法：将携带空载体 pLNCX 和逆转录病毒载体 pLNAFhGS 的重组逆转录病毒 液 分 别 感 染 HepG2/con （ 已 转 双 基 因 空 载 体 的 HepG2 细胞） 细胞 和 HepG2/(hArgI+hOTC)4 细胞（前期构建）；应用抗生素 G418 筛选抗性细胞克隆 并扩增培养， 将 得到 的 抗 性细 胞 克隆 分 别命 名 为 HepG2/Mock 和 HepG2/ hArgI+hOTC+AFhGS 细胞。用 RT-PCR 和 Western-blot 法验证目的基因的表达； CCK-8 法检测抗性细胞株的耐氨能力和增殖能力；生物化学法检测 hArgI 和 hOTC 酶活力和尿素合成量；商品化试剂盒检测谷氨酰胺产量； Western-blot 法 检测人精氨酸酶 I(hArgI)、人鸟氨酸转氨甲酰酶(hOTC)、人氨基甲酰磷酸合成酶 I(hC