花生种皮中一种NBS类抗病基因克隆与序列分析.docVIP

花生种皮中一种NBS类抗病基因克隆与序列分析 　　摘 要:利用植物抗病基因核苷酸结合位点(NBS)的保守区设计一对特异引物,以抗、感黄曲霉病花生品种J11和金花1012的种皮基因组DNA和RNA为材料进行DNA-PCR和RT-PCR扩增,经克隆、测序,得到一条504 bp的目的片段pnbs1,在GenBank上的登录号为GQ199610。Blast和Blastx分析发现pnbs1核苷酸序列与C8V1G10F 抗性蛋白的核苷酸序列的同源性为89%,与抗性蛋白PLTR的氨基酸序列同源性为59%。该片段的氨基酸序列中含有抗病基因NBS区域的3个保守模体:GPGGVGKTT、KKFFIVLDDVW和STILLTTR,推测pnbs1可能是花生NBS类抗性基因的核心区域。 　　关键词:花生种皮;NBS类抗病基因;克隆;序列分析 　　中图分类号:Q785 文献标识号:A 文章编号:1001-4942(2009)12-0001-06 　　 　　花生(Arachis hypogaea L.)是我国重要的油料作物和经济作物,为我国提供了丰富的花生制品和油脂[1]。虽然我国的花生产业在世界上占有非常重要的地位,总产、单产和出口量均居世界首位,但也面临着诸如黄曲霉毒素污染、青枯病、褐斑病、叶斑病等问题[2,3],严重影响着我国花生产业的可持续发展。通过化学药剂防治植物病害,会带来病原物抗性和环境污染问题,其应用受到越来越多的限制。筛选和培育抗病品种是最经济、有效、安全的防御病害的途径,但传统的抗病育种方法周期长、效率低[4]。利用分子标记、转基因等生物技术可以大大缩短选育抗病品种的时间,提高选育效率。 　　图位克隆法和转座子标签法为经典的植物抗病基因分离方法,适用于基因组较小的植物(如拟南芥、番茄等),对小麦、大豆、花生等植物则不适合[5]。已克隆的植物抗病基因在氨基酸水平上表现出了一定程度的相似性,在一些区段高度保守,如核苷酸结合位点(nucleotide binding site, NBS)、亮氨酸拉链(leucine zippers, LZ)、富含亮氨酸重复序列(leucine-rich repeats, LRR)、丝氨酸/苏氨酸激酶(serine-threonine kinase, STK)、跨膜结构域(transmembrane domain, TM)及Toll白介素-1区域(Toll-interleukin-1 region, TIR)等。其中以NBS结构域为主,它能够结合ATP或GTP,在植物抗病反应中起重要作用[6,7]。抗病基因的保守性使得同源性克隆成为可能。同源克隆技术是近年来兴起的基因分离技术,目前已应用于植物抗病基因及其同源物的分离,且已利用其从拟南芥、水稻、小麦、大麦、大豆、玉米、甘薯、黄瓜、番茄和香蕉等植物中分离了许多抗病基因同源片段[5～9,11～18]。 　　花生基因组较复杂且花生栽培种是异源4倍体,遗传背景不清楚,与其它作物相比,花生抗病基因的分离相对滞后,但也已得到了一些抗性基因同源片段。Yuksel等(2005)[22]根据已知的抗病基因保守区设计了4对兼并引物(PLTR、PNTR、PCF、PRGA)和2对特异引物(PCRE、PPTO),利用PLTR引物,获得179个片段,经Blast分析后只有95个片段有完整的开放阅读框, 43个片段含有1个或多个终止密码子。晏立英等(2007)[23]利用已克隆的植物抗病基因的NBS区域设计兼并引物或特异引物,从花生栽培种中花6号幼叶中获得了5条具有连续ORF的抗病基因类似物(Resistance gene analogs, RGAs)序列。本研究根据已知的抗病基因NBS保守区设计一对特异引物,采用同源克隆技术,试图从抗、感黄曲霉病花生品种的种皮中分离出花生抗黄曲霉基因,进而对该基因的组织结构和表达特性进行分析研究,为功能性花生抗病基因的分离和遗传转化奠定基础。 　　 　　1 材料与方法 　　 　　1.1 植物材料 　　抗黄曲霉病花生品种J11和感病品种金花1012种植于日光温室中,在荚果充实期取样,以两品种的种皮作为试验材料。 　　1.2 试剂 　　PCR反应所需试剂,各种限制性内切酶,凝胶回收试剂盒等,购自TIANGEN公司和TaKaRa公司。 　　1.3 方法 　　1.3.1 花生总DNA和总RNA提取 　　利用改良的SDS法[21]提取两花生品种的种皮基因组DNA;采用TIANGEN公司的植物RNA提取试剂盒分别提取两花生品种的种皮总RNA。 　　1.3.2 DNA-PCR扩增 　　根据抗病基因产物的保守NBS结构域设计并合成以下引物: 　　正向Pf: GGACCTGGTGGGGTTGGGAAGACAAC; 　　反向Pr: