花色素对白血病K562细胞增殖和凋亡影响研究.docVIP

花色素对白血病K562细胞增殖和凋亡影响研究 　　【摘 要】目的：研究花色素对K562细胞增殖及凋亡的影响。方法：采用细胞体外培养技术，台盼蓝拒染、MTT法检测细胞增殖抑制率；显微镜观察细胞形态学变化；AnnexinV/PI双标记流式检测细胞凋亡的特征。结果：台盼蓝拒染、MTT检测显示花色素对K562细胞具有增殖抑制作用，并且与时间、浓度呈正相关；显微镜下直接观察到花色素高浓度组细胞分散，胞体减小，凋亡细胞明显增多；流式细胞仪检测到高浓度花色素组K562细胞凋亡率高于对照组。结论：花色素对K562细胞具有增殖抑制作用，并且能够促进K562细胞凋亡。 　　【关键词】花色素 K562细胞 增殖 凋亡 　　白血病是一种造血系统的恶性肿瘤，我国白血病发病率约为2.76/10 万。白血病的发生是由于血细胞增殖失控，分化成熟受阻，正常凋亡程序失调，导致异常分化细胞大量增殖所引起[1]。花色素是植物中广泛存在的多酚类化合物的总称，是一种天然食用色素，安全无毒，而且具有一定营养和药理作用，有研究表明花色素对人乳腺癌、前列腺癌、结肠癌等肿瘤细胞具有生长抑制作用[2-4]，且对机体无明显不良反应。近年来有研究发现花色素能抑制白血病细胞增殖、促进白血病细胞凋亡，能增加化疗药物的敏感性和逆转耐药等[5]。K562细胞是一种分化极差、恶性程度较高的人红白血病细胞株，在体外可被多种诱导剂诱导发生凋亡、分化和增殖抑制[6-8]，是临床和基础领域中筛选新的抗肿瘤药物的常用模型。在此研究背景下，本课题采用不同浓度的花色素对K562细胞作用，分别检测其对K562细胞增殖、凋亡的作用，为临床应用花色素抗白血病治疗提供可靠的理论依据。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 　　花色素购于长春德尔塔生物技术有限公司；RPMI-1640培养基购于美国GIBCO公司；新生牛血清购于杭州四季青生物工程材料有限公司；台盼蓝染液购于上海碧云天生物技术有限公司；MTT试剂盒购于武汉博士生物工程有限公司；annexin V/PI试剂盒购于上海碧云天生物技术有限公司；SM-3型酶标分析仪（北京天石天力医疗器械技术开发中心）；倒置相差显微镜（Olympus公司）；流式细胞仪EPICS XL（美国Beckman Coulter公司）；CO2细胞培养恒温箱（美国 Forma Scientific公司）； K562细胞为吉林医药学院检验学院冻存细胞。 　　1.2 方法 　　1.2.1 台盼蓝染色实验 　　取对数生长期的K562细胞，以每孔9×108/L密度接种于24孔板中，将其分成5组，每组平行设置4个复孔，分别加入不同浓度的花色素，终浓度分别为0μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL（后续试验药物处理均依照此浓度分组），培养48h后采用台盼蓝拒染法计数活细胞数。 　　1.2.2 MTT法检测 　　取对数生长期的K562细胞，以每孔9×108/L密度接种于24孔板中，分别在加药24h、48h、72h后加入MTT溶液10μL，37 ℃继续培养4h，终止培养，离心1000 r/min，5 min，弃去孔内培养液，每孔加入100μL Formazan 溶解液，振荡10 min，用酶标分析仪在570nm波长下测各孔吸光度，按下列公式计算抑制率，IR% = （1-试验组平均A值/对照组平均A值）×100%。 　　1.2.3 显微镜观察细胞形态变化 　　取对数生长期的K562细胞，以每孔9×108/L密度接种于24孔板中，将其分成5组，每组平行设置4个复孔，药物处理48h后，于倒置显微镜下观察细胞状态并拍照。 　　1.2.4 用流式细胞仪检测细胞凋亡 　　取对数生长期的K562细胞，以每孔9×108/L密度接种于24孔板中，药物处理48h后，经PBS洗涤，收集细胞。加人FITC标记的AnnexinV室温避光30 min，再加入PI，避光反应5 min，加入适量Bufer处理细胞后，流式细胞仪进行检测（具体步骤参照试剂盒说明书）。 　　2 结果 　　2.1 台盼蓝染色实验 　　随着花色素浓度的增高，细胞生长抑制率也逐渐增加，提示花色素在体外对K562细胞有明确的增殖抑制作用（见表1）。 　　2.2 MTT法检测 　　MTT结果进一步证实，花色素能够抑制K562细胞生长，随着浓度从25μg/mL增加到200μg/mL，细胞生长抑制率也逐渐增加（见图1）。 　　2.3 显微镜观察凋亡细胞形态 　　对照组：细胞胞体大，呈圆形，聚集成团如葡萄串样，胞浆内未见颗粒。药物组：细胞分散，胞体皱缩，体积减小，凋亡细胞增多且明显，提示花色素对K562细胞有增殖抑制和促进凋亡的作用（见图2）。 　　2.4 流式细胞仪检测细胞凋亡 　　流