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补肾活血方调节miRNA―140―5p表达干预人原代软骨细胞退变研究 　　【摘 要】目的：研究补肾活血方含药血清对白细胞介素-1β（IL-1β）刺激的人原代软骨细胞miRNA-140及其靶基因表达的影响。方法：通过采用生理盐水和补肾活血方分别灌胃雌性SD大鼠制备空白血清和含药血清。将人软骨细胞种植于6孔板并且分为3组。空白对照组和模型对照组细胞培养的血清采用大鼠空白血清，含药血清组细胞培养的血清采用大鼠含药血清。另外，模型对照组和含药血清组细胞加入10 ng?mL-1 IL-1β。以上各组细胞设3个复孔，继续培养细胞至IL-1β刺激后24 h收集各组细胞提取总RNA。采用RT-qPCR检测软骨细胞miRNA-140-5p以及聚蛋白样金属蛋白酶-5（ADAMTS-5）、胰岛素样生长因子结合蛋白5（IGFBP5）和基质金属蛋白酶-13（MMP-13）mRNA表达。结果：与空白对照组比较，模型对照组软骨细胞miRNA-140-5p表达和IGFBP5 mRNA表达明显降低（P 0.05），ADAMTS-5和MMP-13mRNA表达明显升高（P 0.05）；与模型对照组比较，补肾活血方含药血清显著升高了IL-1β刺激的软骨细胞miRNA-140-5p表达和IGFBP5 mRNA表达（P 0.05），并且显著降低ADAMTS-5和MMP-13 mRNA表达（P 0.05）。结论：补肾活血方含药血清可以抑制IL-1β导致的人原代软骨细胞退变，其作用机制与提高miRNA-140-5p和IGFBP5 mRNA表达，降低ADAMTS-5和MMP-13 mRNA表达有关。 　　【关键词】 骨关节炎，膝；补肾活血方；miRNA-140-5p；软骨细胞 　　膝骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA）是全世界最常见的与老龄化相关的退行性关节疾病[1]，使患者产生极大痛苦，给家庭造成沉重负担。中医学认为，KOA发病的病机主要为肾虚血瘀和肾虚络阻。根据补肾、活血、通络和祛风除湿原则筛选中药组成的补肾活血胶囊（后更名为补肾强筋胶囊）为本院院内制剂，多年来的临床及动物实验均证实了其对KOA有良性干预作用[2-5]，但具体作用机制尚不明确。miRNA是广泛存在于真核生物中的一种非编码的小RNA，它主要调控基因转录后水平。大量研究报道表明，miRNA在骨关节炎（osteoarthritis，OA）发病过程中软骨细胞增殖、凋亡以及软骨基质合成与分解代谢等方面发挥了重要的调控作用，其中miRNA-140在维持软骨正常代谢即维持软骨基质稳态的过程中起重要 　　作用[6-7]。 　　本实验采用白细胞介素-1β（IL-1β）作为造模剂在体外复制出退变的软骨细胞模型，研究了补肾强筋胶囊含药血清对IL-1β刺激的软骨细胞miRNA-140-5p及其靶基因聚蛋白样金属蛋白酶-5（ADAMTS-5）、胰岛素样生长因子结合蛋白5（IGFBP5）和基质金属蛋白酶-13（MMP-13）mRNA表达的影响，从miRNA角度探讨其治疗KOA的作用机制。 　　1 实验材料 　　1.1 实验动物 SPF级SD雌性大鼠10只，体质量180～220 g，购自广东省医学实验动物中心，实验动物中心生产许可证号：SCXK（粤）2013-0002。 　　实验动物质量合格证号：NO44007200021993。本研究在广东省第二中医院（广东省中医药工程技术研究院）SPF级动物实验室进行，设施使用许可证号：SYXK（粤）2015-0059。 　　1.2 实验仪器 ClassⅡType B2型生物安全柜（新加坡Esco公司）；DMI8型倒置荧光显微镜（德国Leica公司）；3111型CO2细胞培养箱（美国Thermo Scientific公司）；Cellometer Mini型自动细胞计数仪（美国Nexcelom公司）；BSA224S型电子分析天平（德国Sartorius公司）；5424型小型高速离心机（德国Eppendorf公司）；Milli Q Plus型超级纯水仪（美国Millipore公司）；702型超低?乇?箱（美国Thermo Scientific公司）；Smart-Spec plus 型核酸蛋白测定仪（美国Bio-Rad公司）；ViiA7型实时荧光定量PCR系统（美国Thermo公司）。 　　1.3 药物和试剂 本研究所用的补肾强筋胶囊由广东省第二中医院制剂室提供（生产批；高糖DMEM培养基（美国Gibco公司，生产批号8116358）；澳洲胎牛血清（美国Corning公司，生产批；胰蛋白酶（美国Gibco公司，生产批号1846496）；DPBS（美国Corning公司，生产批）；重组人IL-1