皮肤变态反应局部淋巴结试验（LLNADA）.PDFVIP

皮肤变态反应：局部淋巴结试验（LLNA:DA ） （征求意见稿） 1 范围 本方法规定了局部淋巴结试验 （LLNA:DA ）的基本原则和试验要求。 本方法适用于化妆品原料皮肤变态反应的测定。 2 试验目的 确定重复接触化妆品原料对哺乳动物皮肤局部是否可变态反应及其程度。 3 定义 3.1 皮肤变态反应（过敏性接触性皮炎）skin sensitization，allergic contact dermatitis 皮肤对一种物质产生的免疫源性皮肤反应。在人类这种反应可能以瘙痒、红斑、丘疹、 水疱、融合水疱为特征。动物的反应不同，可能只见到皮肤红斑和水肿。 3.2 皮肤刺激性 dermal Irritation 皮肤涂抹受试物后局部产生的可逆性炎性变化。 3.3 刺激指数 stimulation index 计算一种测试物质皮肤致敏潜力的值，是受试物组与阴性对照组的增殖率比值。 4 试验原理 过敏原引起测试物质染毒部位引流淋巴结内淋巴细胞增殖，其增殖程度与过敏原的剂量 和效力成比例。通过生物发光法测定耳廓淋巴结内淋巴细胞ATP含量（已知与活细胞数相关） 从而评价其增殖程度。生物发光法利用荧光素酶（Luciferase ）催化ATP和荧光素（Luciferin ） 反应同时发光，其光强度与ATP浓度线性相关。通过计算受试物组与阴性对照组ATP含量比 值即刺激指数评价受试物的皮肤致敏性。 + + 2 → + + + 2 + ℎ 5 试验的基本原则 5.1 实验动物和饲养环境 选用SPF级BALB/c小鼠，8～12w龄，雌性，未孕或未曾产仔的。体重差异应不超过平 均体重的20% ，皮肤应健康无损伤。实验动物及实验动物房应符合国家相应规定。选用标准 配合饲料，饮水不限制。 5.2 动物试验前准备 试验前动物应在实验动物房环境中至少适应5 d时间。将动物随机分组标记（不要做任 1 何形式的耳朵标记），检查皮肤应健康无损伤。试验开始和结束时应记录动物体重。 5.3 可靠性检查 每次试验均需设置阳性对照组，阳性物一般采用25% 己基肉桂醛（CAS号101-86-0 ）或 25%丁子香酚（CAS号97-53-0 ），溶剂为丙酮：橄榄油（AOO ，4:1，v/v ）。当阳性物与受试 物的溶剂不同时，需另单独设置阳性物的溶剂对照组。 5.4 试验期间每天观察动物临床症状及耳朵局部刺激症状，并做完整记录。 6 试验方法 进行本试验前，需通过预试验（每组 1~2 只动物）排除受试物引起全身毒性和（或）局 部皮肤中度刺激性。筛选最大剂量水平要求：液体受试物达到100%浓度，固体或悬浮液达 到最大可能浓度。 6.1 动物与分组 动物随机分为阴性（溶剂）对照组、阳性对照组和受试物组（至少3个浓度），每组至 少4只动物。 6.2 受试物配制 固体受试物应溶于或悬浮于适当溶剂中并稀释，液体受试物可以直接或稀释用。受试物 应现用现配。 6.3 溶剂的选择 常用溶剂为丙酮：橄榄油（AOO ，v/v 4:1 ），N,N-二甲基甲酰胺（DMF ）、甲乙酮（MEK ）， 丙烯乙二醇、二甲基亚砜（DMSO ）等。 6.4 剂量水平 受试物最高浓度应不引起动物全身毒性和（或）局部皮肤中度刺激性，通过预试验按合 适浓度梯度如100%, 50%, 25%, 10%, 5%, 2.5%, 1%, 0.5%等选择三个连续的试验浓度。 6.5 试验步骤 6.5.1 第1天 动物随机分组、标记、称重、记录临床症状。将1%十二烷基硫酸钠（SLS）均匀涂抹 到小鼠双侧耳朵背部皮肤。刷子或棉签应浸泡在SLS溶液中，并在小鼠每个耳朵背部重复涂 抹4~5次。1 h后再涂抹受试物、阴性对照或阳性对照25 μL/耳。 6.5.2 第2，3，7 天 操作同第1 天，重复1%SLS 溶液预处理和受试物涂抹。 6.5.3