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苯甲酰甲腈水解酶产生菌的筛选及应用研究-有机化学专业论文
常州大学学位论文原创性声明
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书。
学位论文作者签名: 签字日期: 年 月 日
导师签名: 签字日期: 年 月 日
中 文 摘 要
苯甲酰甲酸是一种重要的有机合成中间体,能够广泛地应用于农药 和医药等的合成。随着科学和技术的发展,苯甲酰甲酸应用领域不断扩 大,对其需求也逐年提高,其高效合成越来越引起许多专家学者的重视。 利用苯甲酰甲腈水解酶可以实现苯甲酰甲酸的合成,该工艺反应条件温 和,得到的产品质量高,符合绿色化学的发展要求,具有广阔的开发前 景。本文旨在建立一种高通量的腈水解酶筛选方法,从自然界中筛选到 高活性苯甲酰甲腈水解酶产生菌。进一步优化其发酵培养条件及催化反 应条件,并扩展底物谱最大限度的挖掘其作为生物催化剂的潜力。为了 提高生物催化剂的稳定性及重复利用率,采用海藻酸钙包埋法进行细胞 固定化,考察固定化细胞的部分催化特性,最后对 CCZU10-1 催化苯甲 酰甲腈的水解产物进行分析。
首先,基于改进的羟肟酸铁比色法建立了腈水解酶高通量的筛选方 法。优化并确定了最适显色反应条件:0.5 mL N,N-二环己基碳二亚胺 (0.60 mol·L-1) 和 1.0 mL 高氯酸羟胺(0.070 mol·L-1) 分别添加到 50 μL 待测样品中,混合均匀后在室温(25℃~35℃)条件下恒温反应 15 min 之后, 0.7 mL 酸性氯化铁(0.040 mol·L-1)溶液立即加入到混合液中,在 520nm 波 长下检测吸光度。最终建立了一种简单、快速、高通量的腈水解酶筛选 方法,同时对该方法的准确性进行了验证。并且通过与液相色谱法检测 结果进行对比,结果表明羟肟酸铁比色法对有机羧酸的检测具有较高的 准确性。
然后,依次以烟腈和苯甲酰甲腈为唯一氮源,通过富集培养,从土 壤中分离出一株产高活性腈水解酶的菌株,通过对其形态特征观察及生 理生化鉴定,结合 16S rDNA 序列测定结果分析,最终确定目标菌株菌为 红球菌属(Rhodococcus),并将其命名为 Rhodococcus sp. CCZU10-1。
其次,对目标菌株 Rhodococcus sp. CCZU10-1 的产腈水解酶培养条 件及催化反应条件进行优化,确定了最适培养条件:碳源为 10 g·L-1 的葡 萄糖,氮源为 10 g·L-1 蛋白胨与 5 g·L-1 酵母膏组合,以及在发酵进行 24h
时添加 5 mmol·L-1 己内酰胺作为诱导剂。此条件下腈水解酶活力为 38.34
U·mL-1。最适催化反应条件为:反应温度为 30℃,反应 pH 为 7.0,底物 浓度为 100 mmol·L-1,助溶剂为甲苯(2%, v/v),金属离子添加剂为 Ca2+ (0.1
mmol·L-1)。在最适反应条件下进行催化反应,60 h 后苯甲酰甲酸产率最
高可达 98.22%。同时,本研究考察了 CCZU10-1 腈水解酶对其它腈类化 合物的降解情况,结果表明目标菌株具有较宽的底物谱。
最后,利用海藻酸钙包埋法对细胞进行固定化,并考察了其部分催 化特性,确定最适反应条件:底物浓度 150 mmol·L-1,反应温度为 35℃,
反应 pH 为 7.0。对固定化细胞的稳定性研究结果表明,与游离细胞相比,
固定化细胞能够表现出更高的稳定性,可以重复使用多次。并且,利用 固定化细胞进行催化反应,产物易分离,操作简便。进一步对固定化细
胞催化水解苯甲酰甲腈获得的产物苯甲酰甲酸进行制备,最终通过高效
液相色谱法及核磁共振分析确定产物的正确性。
关键词:苯甲酰甲腈; 苯甲酰甲酸; 腈水解酶; 筛选; 优化
ABSTRACT
Benzoylformic acid is an important intermediate for organic synthesis because it could be
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