吡咯喹啉醌对谷氨酸损伤神经元的保护作用及机制研究-人体解剖与组织胚胎学专业论文.docx

吡咯喹啉醌对谷氨酸损伤神经元的保护作用及机制研究 中文摘要 吡咯喹啉醌对谷氨酸损伤神经元的保护作用及机制研究 中文摘要 目的： 1. 观察吡咯喹啉醌（PQQ）对体外培养海马神经元谷氨酸损伤的保护作用，并 初步探讨其作用机制。 2. 观察 PQQ 对谷氨酸脑内注射大鼠模型神经元损伤的保护作用，并分析其作 用机制。 方法： 1. 体外培养胚胎大鼠海马神经元，神经元特异性染色（MAP2）鉴定神经元纯 度；通过 CCK-8 法检测不同浓度 PQQ（12.5 μM、25 μM、50 μM、100 μM）对正常 培养海马神经元细胞活力的影响。 2. 建立原代培养的海马神经元谷氨酸急性损伤模型（125 μM，15 min），通过细 胞形态观察和 CCK-8 法，观察 PQQ 对谷氨酸损伤海马神经元形态和细胞活力的影响。 3. 通过 Hoechst 33342 和 TUNEL 染色，观察 PQQ 对谷氨酸损伤海马神经元凋 亡的影响。 4. 通过 Western blot 和 Caspase-3 酶活性检测，观察 PQQ 对谷氨酸损伤海马神 经元凋亡相关蛋白 Bcl-2 和 Bax 蛋白表达及凋亡相关蛋白酶 Caspase-3 活性的影响。 5. 钙离子荧光探针 Fluo-4/AM 标记海马神经元，激光共聚焦显微镜下检测 PQQ 对谷氨酸诱导的 Ca2+内流的影响。 6. 通过 TMRM 染色，检测 PQQ 对谷氨酸诱导的海马神经元线粒体膜电位改变 的影响。 7. 通过活性氧（ROS）、超氧化物歧化酶（SOD）、还原型谷胱甘肽（GSH）、丙 二醛（MDA）和一氧化氮（NO）分析，观察 PQQ 对谷氨酸损伤神经元氧自由基生 成及清除的影响。 8. 通过线粒体氧化呼吸链不同复合物的抑制剂应用，寻找 PQQ 在线粒体自由基 清除中可能的作用靶点。 I   PAGE 4 III 中文摘要 吡咯喹啉醌对谷氨酸损伤神经元的保护作用及机制研究 9. 通过 Western blot 检测 Akt、GSK3β、JNK 和 P38 蛋白磷酸化水平的表达变化， 并加入相应通路抑制剂，观察各抑制剂对 PQQ 保护功能的影响，寻找 PQQ 保护作用 相关的信号转导途径。 10. 通过免疫荧光化学观察 PQQ 对谷氨酸损伤海马神经元 Nrf2 表达定位的影响， 实时定量 PCR 检测 PQQ 对转录因子和抗氧化基因（Nrf1、Nrf2、HO-1、GCLC）的 表达影响，并观察 PI3K 抑制剂的影响作用。 11. 构建谷氨酸脑内注射模型，TUNEL 检测 PQQ 在体内对大脑皮层神经细胞凋 亡的影响，FCM 分析 PQQ 对谷氨酸脑内注射大鼠皮层细胞 ROS 生成的影响，并检 测 SOD、GSH 和 MDA 活性及含量的变化。 12. 通过实时定量 PCR 和 Western blot 检测 PQQ 对谷氨酸脑内注射大鼠皮层细胞 转录因子和抗氧化基因（Nrf1、Nrf2、HO-1、GCLC）表达及磷酸化 GSK3β 表达的 影响。 结果： 1. 原代培养的海马神经元纯度较高，达 95%以上，0~100 μM 浓度范围内 PQQ 对正常培养的神经元细胞活力没有显著影响。 2. PQQ 对谷氨酸损伤的海马神经元具有保护作用，能抑制细胞活力的下降和减 少细胞凋亡的产生，并呈现剂量依赖效应，在浓度为 100 μM 时作用最佳。 3. PQQ 能调节谷氨酸损伤海马神经元中凋亡相关蛋白 Bcl-2 和 Bax 的比例，降 低凋亡蛋白酶 Caspase-3 的活性。 4. PQQ 能稳定线粒体膜电位，减少谷氨酸诱导的 Ca2+内流。 5. PQQ 通过抑制谷氨酸损伤神经元中 ROS 的生成及增加 ROS 的清除，减少氧 化应激损伤。 6. 线粒体复合物 I、III 和 IV 抑制剂能增加海马神经元中 ROS 的生成，PQQ 能 减少复合物 I 和 III 抑制剂诱导的 ROS 增加，提示其作用靶点可能位于复合物 I 和 III。 7. PQQ 能维持谷氨酸损伤神经元中 Akt 的持续活化并激活其下游 GSK3β 信号， 同时抑制 JNK 信号的激活。使用 PI3K 抑制剂可以阻断 PQQ 对神经元的保护作用及 对凋亡蛋白比例的调节。 8. PQQ 能促进 Nrf2 的核转位和表达，增加下游 ARE 依赖抗氧化基因 HO-1 和 GCLC 的表达，这种作用可以被 PI3K 抑制剂所抑制。 吡咯喹啉醌对谷氨酸损伤神经元的保护作用及机制研究 中文摘要 Abstract Protective effects and mechanisms of pyrroloquinoline quinine on glutamate induced neuronal damage 9. P