超声微泡联合双自杀基因慢病毒载体pLenti6―EGFP―KDRP―CDTK构建与鉴定.docVIP

超声微泡联合双自杀基因慢病毒载体pLenti6―EGFP―KDRP―CDTK构建与鉴定 　　【摘 要】目的：构建较稳定的超声微泡包裹的双自杀基因慢病毒载体，为恶性肿瘤靶向基因治疗的实验研究奠定基础。方法：提取正常人外周血gDNA扩增出KDRP、CD、TK基因，链接到pMD18-T载体上，经酶切后连接到相应的pLenti6-EGFP载体上，转染至293T细胞，荧光显微镜下观察GFP的表达情况，并计算病毒滴度；取声诺维微泡混悬液，滴加入病毒载量的病毒上清液孵育，测定其外观、包封率、载药量、粒径大小以及稳定度等。结果：得到高滴度（3.5×1012pfu/L）的双自杀基因慢病毒载体pLenti6-EGFP-KDRP-CD/TK；成功获得较稳定的载药微泡，粒径范围92%以上为2～5μm，平均粒径约2.90μm；其包封率为90.6±3.1%，载药量为29.2±0.9%。结论：成功制备质量较好超声微泡包裹的pLenti6-EGFP-KDRP-CD/TK，为临床实时可视状态进行超声定位控释和载质粒微泡基因治疗肿瘤奠定了基础。 　　【关键词】超声微泡；双自杀基因慢病毒载体；基因治疗 　　【中图分类号】R341 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2012）13-0013-02 　　目前，基因治疗已成为一种全新的肿瘤治疗模式，其中自杀基因治疗是一种颇具临床应用潜力的治疗策略， 但是由于治疗的靶向性成为关系到治疗安全性的瓶颈问题。近年来研究表明[1-5]，超声微泡造影剂有望成为一种新型的体内靶向给药的载体系统。本研究旨在构建超声微泡包裹的特异性双自杀基因慢病毒载体，为临床实时可视状态进行超声定位控释和载质粒微泡基因治疗奠定基础。 　　1 材料与方法 　　1.1 双自杀基因慢病毒载体pLenti6-EGFP-KDRP-CD/TK的构建与包装 　　1.1.1目的基因的扩增与TA克隆 　　提取正常人外周血gDNA，并通过PCR方法扩增出KDRP、CD、TK基因；回收 　　PCR产物并分别将其链接到pMD18-T载体上，构成重组T质粒；抽提质粒，并对各重组T质粒的酶切鉴定及测序； 　　1.1.2 慢病毒载体构建与包装鉴定 　　将经测序证实的T-KDRP、T-CD、T-TK三种质粒上的KDRP、CD、TK元件通过特定的限制性内切酶酶切后，依次连接到经相应酶酶切的pLenti6-EGFP载体上，经脂质体法转染至293T细胞，24h后通过荧光显微镜即可见GFP荧光表达，72h后收集上清，0.45um滤器过滤，25000rpm离心90min，沉淀溶于Hanks溶液，-80℃贮存备用。将梯度稀释的病毒液，加入293T细胞中，72h后置于荧光显微镜下观察GFP的表达情况，计数发荧光细胞数目，根据病毒用量和稀释度计算滴度。按公式计算病毒滴度： 　　病毒滴度=GFP细胞阳性数×病毒上清稀释倍数/0. 4m1（pfu/ml）。 　　1.2 载药粒微泡的制备于鉴定 　　1.2.1载药粒微泡的制备 　　声诺维sonovue为磷脂包裹的六氟化硫（SF6），按使用说明注入生理盐水5 ml震荡形成微泡混悬液。取50ul微泡悬液于1.5mlEP管内，再滴加入100MOI病毒载量的病毒上清液，轻轻混匀后室温孵育20 min。 　　1.2.2载药粒微泡的鉴定方法。 　　采用Malvern激光测量仪检测载药微泡的粒径大小，光学显微镜观察其外观，采用反相高效液相色谱法（RP-HPLC）测定载药微泡的包封率和载药量。 　　（1）粒径大小比较 　　载质粒微泡为白色混悬液，PBS（Phosphate buffered saline 磷酸盐缓冲生理盐水）冲洗，静置后分三层，上层、中间层为微泡，下层为PBS液。去除上层及下层液，取中层液，测定其粒径大小，镜下比较观察载药微泡与空白微泡外观。 　　（2）包封率的测定 　　将制备好的含有慢病毒载体的微泡溶液中加入5%乙醇1 mL混匀，6℃，16000 rpm高速离心20min，去上层微泡，取下层液体，加5%乙醇0.5 mL稀释冲洗，再加入适量乙醚，漩涡振摇，6000 rpm离心15 min，取乙醚层，50℃水浴挥干后，加0.5 mL甲醇溶解作为样液，进样量10μL。采用RP-HPLC测定双自杀基因慢病毒载体pLenti6-EGFP-KDRP-CD/TK的包封率，按下式计算包封率： 　　包封率（%）=[（投入药量―游离药量）/投入药量]×100% 　　（3）载药量的测定 　　以下式计算载药量： 　　载药量%=（Wt～Wi）/Wc×100% 　　其中Wt为脂质微泡溶液中药物总含量，Wi为游离药物量，Wc为磷脂用量。 　　（4）稳定性测定 　　4℃冰箱贮存，对短期内的载药微泡溶液的质量进行监测。 　　取少量载药微泡混悬液分别于1d、2d、5d、8