超声提取桦褐孔菌子实体多糖及多糖对癌细胞作用研究.docVIP

超声提取桦褐孔菌子实体多糖及多糖对癌细胞作用研究 　　摘要：采用正交试验优化桦褐孔菌子实体多糖的超声提取工艺条件，并对提取多糖的抗肿瘤活性进行研究。结果表明，桦褐孔菌多糖超声提取的最佳工艺条件为超声时间70 min，温度80 ℃，频率20 kHz，加水量12倍水，其多糖在体外对肝癌HEPG2细胞株具有明显的抑制作用，并可诱导肿瘤细胞凋亡，体内实验发现多糖可显著抑制小鼠S180肉瘤的生长，并具有增强免疫作用。?? 　　关键词：桦褐孔菌子实体多糖；?A正交实验；?A超声提取；?A肝癌细胞；?A吞噬指数K?? 　　中图分类号：R151.3;S646.01?ξ南妆晔堵耄?A?? 　　 　　桦褐孔菌[Inonotus obliquus (Fr.) Pilat]主要分布于俄罗斯北部、北欧、日本北海道、中国黑龙江和吉林长白山等北纬40°～50°地区，民间广泛用于辅助防治各种疑难杂症，如胃癌、肝癌、肠癌等消化器官癌症、心脏病、糖尿病[1]，另有报道桦褐孔菌子实体水提物对HIV有治疗作用[2]。从桦褐孔菌中寻找新的抗肿瘤活性成分并研究其药理和临床作用具有十分重要的意义[3]。本试验对超声提取桦褐孔菌子实体多糖的最佳工艺条件进行研究，并研究了桦褐孔菌多糖对肝癌HEPG2细胞株体外和S180肉瘤瘤株体内的抗增殖作用。?? 　　 　　1 材料与方法 　　 　　1.1?Σ牧? 　　桦褐孔菌子实体粉末为大连野生灵芝生物科技有限公司提供。S180肉瘤瘤株、肝癌HEPG2细胞株为辽宁大学生命科学院细胞工程实验室保存。?? 　　1.2?σ瞧? 　　超声波破碎仪为无锡锡山德嘉电子有限公司产品，冷冻离心机D??37520为德国HERAEUS公司产品，全波长紫外-可见分光光度计VARIAN50caco为美国瓦里安技术有限公司产品，CO??2培养箱Heraeus BB15为德国THERMO Heraeus公司产品，倒置荧光显微镜Olympus CKX41为日本Olympus公司产品，酶标仪Multiskan MK3为德国Multiskan公司产品。?? 　　1.3?κ约? 　　乙醇、正丁醇、氯仿，噻唑蓝(MTT)和二甲基甲砜（DMSO）为国产分析纯试剂，EB, 丫啶橙，印度墨汁为上海向群中学化学试剂厂产品，新生小牛血清为澳大利亚Maverick公司产品，RPMI??1640为日本株式会社制药有限公司产品，丝裂霉素MCK和紫杉醇为上海金和生物技术有限公司产品。?? 　　1.4??桦褐孔菌多糖的超声优化制备 　　本实验采用正交表L??9（34）对超声频率、超声时间、温度和加水量4个因素进行了优化试验。正交因素水平见表1。分别称取8 g桦褐孔菌子实体粉末按表1设定各因素水平，按表2进行多糖提取2次，1000 r/min离心15 min，合并上清，80 ℃加热浓缩至粘稠状。搅拌浓缩液同时加入95%乙醇，使乙醇含量达80%，静置过夜，次日收集沉淀，用乙醇洗涤3次，低温干燥，得粗品。Sevag法[4]去蛋白，4 ℃过夜，上清液浓缩后80 ℃干燥3 h，得桦褐孔菌子实体粗多糖粗品。用硫酸―苯酚法[4]于490 nm处测定OD??490，作标准曲线。称取干燥后的Inonotus obliquus polysaccha??ride (IOP) 40 mg，放入500 mL容量瓶，操作方法同标准曲线制作[4]，蒸馏水定容至刻度后测定OD??490。计算多糖得率。 　　 　　1.5??桦褐孔菌多糖对肝癌HEPG2细胞株的作用[5] 　　肝癌HEPG2细胞接种于RPMI??1640培养液中培养，取对数生长期浓度为(3~5)×105/mL的细胞悬液，接种于96孔培养板内[6,7]。试验包括：①空白对照组，不含癌细胞的培养液100 μL+0.9%生理盐水10 μL，②阳性对照组，细胞悬液100 μL+10 μL丝裂霉素(1、2、4、8、12和16 μg/mL)，③多糖组，细胞悬液100 μL+10 μL IOP （1、2、4、8、12和16 μg/mL）和④阴性对照组，细胞悬液100 μL+0.9%生理盐水10 μL。置CO??2培养箱（37 ℃，5% CO??2）内培养44 h后，用酶标仪在570 nm波长处用MTT快速比色法检测各孔吸收值，并计算药物抑制率。?? 　　1.6??DNA ladder电泳 　　取肝癌HEPG2细胞株37 ℃传代培养，稀释至2×104/mL，设立阴性空白对照，实验组加8 mg/mL，12 mg/mL及16 mg/mL多糖各100 μL于1000 μL培养液中，培养48 h后进行DNAladder电泳[8，9]。收集各组细胞，1000 r/min离心5 min后去上清，沉淀中加入TE混匀，1000 r/min离心5 min