荧光定量PCR技术专题080919.ppt

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 拷贝数的计算： 待测样本浓度（ng/ul）＝OD260×40×稀释倍数 样本分子量=碱基数×324 待测样本拷贝数（copies/ul）=待测样本浓度/样本分子量×6×1014 倍比梯度稀释方法： 1v原液(标准品i) +9v稀释缓冲液，得标准品ii 1v标准品ii+9v稀释缓冲液，得标准品iii 1v标准品iii +9v稀释缓冲液，得标准品iv 1v标准品iv +9v稀释缓冲液，得标准品v 质粒标准品稀释方法与拷贝数计算 方 法：从血液中提取病毒DNA，以TaqMan探针法进行荧光定量检测 试 剂：TIANGEN公司探针法试剂RealMasterMix（Probe）（目录号：FP203） 标准品：质粒标准品浓度为106、105 、104 、 103 ；2个重复；设阴性空白对照 实验步骤：提取HBV DNA； 设计特异引物； 设计TaqMan探针并标记探针； 荧光定量扩增； 结果分析：获取血液样品中HBV DNA的精确copy数。 绝对定量实验例——乙肝病人血液中HBV的绝对定量 Sample copies/ml Ct1 Ct2 Mean Ct STD 标准品 5×103 28.18 28.64 28.41 0.16 标准品 5×104 25.25 25.14 25.19 0.04 标准品 5×105 22.11 22.46 22.28 0.12 标准品 5×106 18.63 18.92 18.77 0.10 未知样品 ? 20.56 20.45 20.5 0.05 空白对照 None None 实验数据 绝对定量实验例——乙肝病人血液中HBV的绝对定量 扩增效率（E）计算 E = 10-1/斜率 －1 = 10-1/-3.29 －1 = 2.01－1 = 1.01 标准曲线制作：利用Mean Ct 作图可得到标准曲线 y = -3.29x + 40.33 R2 = 0.9978 绝对定量实验例——乙肝病人血液中HBV的绝对定量 相关系数（R2）：大于0.98，越接近1，结果可信度越高。 扩增效率（E）：0.9-1.1, 越接近1，越理想。 未知样品拷贝数的计算 将Ct值带入线性方程： 20.5= -3.29 X + 40.33 QuantityUnknown=10 6.03 =1,071,519 copies 绝对定量实验例——乙肝病人血液中HBV的绝对定量 X= 20.5-40.33 -3.29 =6.03 相对定量解析方法 理论上目的基因表达量分析条件 Sample B Sample A 目的基因扩增效率相同 RNA提取效率相同 细胞起始数相同 实际目的基因表达量分析 相对定量的必要性 必须用内对照基因（管家基因）进行校正，进行相对表达量分析。 双标准曲线法 2 -△△Ct法 相对定量分析——两种常用的分析方法 通过标准曲线对对照样品、待测样品的目的基因及管家基因进行定量，然后根据计算公式求得相对值即为相对表达量。 相对值= 校正值= 目的基因定量结果 管家基因定量结果 待测样品的校正值 对照样品的校正值 相对定量分析——双标准曲线法 公式： = 对照样品管家基因定量结果 对照样品目的基因定量结果 待测样品目的基因定量结果 待测样品管家基因定量结果 优点：分析简单，实验优化相对简单 缺点：对每一个基因，每一轮实验都必需做标准曲线 应用：基因表达调控研究中最常用与公认的两种相对定量方法之一 相对定量分析——双标准曲线法 检测样品 管家基因H 目的基因X 定量结果 定量结果 校正值 相对量 对照样品 6391.5 343.4 0.0537 1.000 待测样品1 8589.7 17.3 0.0020 0.037 待测样品2 7432.9 1946.1 0.2618 4.874 实验数据 公式： 相对定量分析——2 法 优点：无需作标准曲线 缺点：假定扩增效率为 100 %；