贵州疣螈冬眠期消化系统蛋白酶活性研究.docVIP

贵州疣螈冬眠期消化系统蛋白酶活性研究 　　摘要　本实验在不同温度和不同pH值条件下对冬眠期贵州疣螈主要消化器官蛋白酶活性进行了测定。结果表明：冬眠期贵州疣螈胃、前肠、中肠、后肠和肝脏蛋白酶最适pH值分别为2.2、8.2、7.４、7.8、2.2，最适温度分别为45℃、50℃、30℃、30℃、45℃。在最适pH值和最适温度条件下，蛋白酶活性分别为1 600.04、2 102.62、124.89、90.50、95.33个酶活性单位，蛋白酶活性最高的是前肠，最低的是后肠。 　　关键词　贵州疣螈；蛋白酶；活性；最适pH值；最适温度 　　贵州疣螈是我国特有种，为国家Ⅱ级保护动物，分布于贵州西部的威宁、毕节、水城、大方、织金、赫章、纳雍，云南的彝良、永善。有关贵州疣螈生物学及繁殖生理学方面已有学者进行了研究，但对其冬眠期形态生态学和生理生化方面的研究还很少。本研究对贵州疣螈冬眠期消化系统蛋白酶的活性进行了初步探讨，旨在丰富其消化生理的研究内容及为教学科研单位疣螈饲养的人工饲料研制提供理论依据。 　　 　　1材料与方法 　　 　　1.1材料 　　实验疣螈采自贵州毕节，采回实验室后饲养于水簇箱中，冬眠期进行实验。 　　1.2酶液制备 　　取实验用疣螈，称重，测量体长，在冰盘中解剖，取消化道和肝脏，去肠系膜和脂肪，用无离子冰水冲去肠内容物，将消化道分为胃、前肠、中肠、后肠（肠道分段根据其外部形态特征，分段方向从前往后），称重，用无离子水冰浴匀浆，用6 000rpm冰冻离心30mm，取上清液保存于-35℃低温冰箱中备用。 　　1.3蛋白酶活性的测定 　　用Folin酚法测蛋白酶活性。蛋白酶活性定义：以质量分数为1.0%的酪蛋白为底物， 在相应条件下，1g新鲜组织1min催化生成1mg酪氨酸为1个酶活性单位（μg/g?min）。用北京普析生产的T6紫外可见分光光度计在680nm处测定。参照周景祥[1]的方法进行测量和计算。 　　1.3.1最适pH值测定。在pH值2.2～7.8范围内，采用磷酸氢二钠―柠檬酸缓冲液体系，在pH值8.2～9.4范围内，采用巴比妥钠―盐酸缓冲液体系，以pH值增减0.4值为梯幅，共设19个pH值梯度。实验时以pH-3型数显酸度计进行校正。反应温度为30℃。 　　1.3.2最适温度测定。用恒温水浴锅，投入式制冷器设定，在5～60℃范围内，以5℃为梯幅，共设12个温度梯度。测定最适温度时所取pH值，根据最适pH值测定结果选定。 　　 　　2结果 　　 　　2.1蛋白酶的最适pH值 　　在30℃、pH值2.2～9.4范围内，测得各pH值条件下贵州疣螈胃肠道和肝脏蛋白酶活性，结果见表1。 　　从表1可知，贵州疣螈胃和肝脏蛋白酶活性的最适pH值均为2.2，前肠的最适pH值为8.2，中肠的最适pH为7.4，后肠的最适pH值为7.8。 　　2.2蛋白酶的最适温度 　　在温度5～60℃范围内，测得各温度条件下胃肠道和肝脏蛋白酶活性，结果见表2。 　　从表2可知，在最适pH值下，贵州疣螈冬眠期胃肠道和肝脏蛋白酶活性的最适温度在30～50℃之间，前肠的最 　　适温度最高为50℃、胃和肝脏次之为45℃、中肠和后肠为30℃。 　　2.3消化道及消化腺蛋白酶活性比较 　　以最适pH值条件下，最适温度和5℃时冬眠期贵州疣螈胃肠道和肝脏蛋白酶活性进行比较，如表3。 　　从表3可看出，在最适pH值和最适温度条件下，冬眠期贵州疣螈胃肠道和肝脏中蛋白酶活性从高到低依次为： 前肠＞胃＞中肠＞肝脏＞后肠，前肠和胃的酶活性远高于其余各检测部位。在最适pH值和5℃温度条件下，冬眠期贵州疣螈胃肠道和肝脏中蛋白酶活性从高到低依次为： 胃＞前肠＞肝脏＞中肠＞后肠，胃和前肠的酶活性稍高于其余各检测部位，最适温度条件下的酶活力远高于5℃温度条件下的酶活力。 　　 　　3讨论 　　 　　3.1pH值对蛋白酶活性的影响 　　如表1所示，冬眠期贵州疣螈胃肠道和肝脏各部分蛋白酶活性受pH值的影响不同，pH值2.2~5范围内，胃蛋白酶活性呈显著下降趋势，pH值5.4~9.4范围内胃蛋白酶活性缓慢下降，酶活性相差很小。肝脏蛋白酶活性在pH值2.2~4.6范围内逐渐降低。从pH值5.0起又逐渐升高，在pH值7.8后逐渐降低，整个曲线出现2次波峰，分别处于酸性和碱性环境下，但蛋白酶活性都很低。肠道蛋白酶活性在pH值2.2~4.6范围内呈抑制状态，各部分酶活性相差很小；从pH值5.0开始，随着pH值的升高，除前肠蛋白酶活性增幅明显外，中肠、后肠蛋白酶活性增幅不明显，到达最适pH值之后随pH值的升高，其酶活性呈显著下降趋势。从整个检测部位来看，胃蛋白酶的活性受pH值的影响最大。 　　3.2温度对蛋白酶活性的影响 　　从表2可看出，