地衣芽孢杆菌原生质体电转化方法的研究-生物通.PDFVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１５，３５（７）：７６８２ ＤＯＩ：１０．１３５２３／ｊ．ｃｂ 地衣芽孢杆菌原生质体电转化方法的研究 １ ２ 温　赛 　杨建国 （１北京工商大学食品学院食品风味化学北京市重点实验室 食品添加剂与配料北京高校工程研究中心　北京　１０００４８） （２北京化工大学生命科学与技术学院　北京　１０００２９） 摘要　为了解决地衣芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）工业菌株难以转化的问题，将原生质体制备、 电穿孔和原生质体再生技术相结合，建立了一种地衣芽孢杆菌原生质体电击转化方法。在对菌 体生长状态、溶菌酶作用时间、电转电压、渗透压保护剂等条件进行优化后，试验了将不同类型的 表达载体，即游离型质粒ｐＧＪ１０３（３．３ｋｂ）和整合型质粒ｐＡＸ０１（９．３ｋｂ），分别转入两株地衣芽孢 杆菌工业生产菌株Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓＣＩＣＣ１０１８１和Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓＣＩＣＣ２０２０４中。实验结果显示， 对数生长期后期的菌体酶解４０ｍｉｎ后制备的地衣芽孢杆菌原生质体得率为９６％，再生率达２５％ 以上。原生质体与质粒ＤＮＡ在最适电压０．６ｋＶ／ｍｍ下电击转化，并以０．５ｍｏｌ／Ｌ山梨醇或甘露醇 ２ ２ 作为渗透压保护剂进行再生培养后，最终游离型质粒的转化率可达０．８８×１０～１．１×１０ＣＦＵ／ｇ μ ２ ２ ｐＧＪ１０３，整合型质粒的转化率达到０．４５×１０～０．５２×１０ＣＦＵ／ｇｐＡＸ０１。该方法为地衣芽孢杆 μ 菌野生工业菌株的遗传改造提供了一种新的、高效的转化手段。 关键词　地衣芽孢杆菌　原生质体　电转化 中图分类号　Ｑ７８ 　　自１８７２年芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）作为一个属被首次 效方法将外源ＤＮＡ（载体）转化进入宿主细胞是对地衣 提出后，芽孢杆菌已经成为现代发酵工业的核心菌种。 芽孢杆菌进行遗传改造的前提。与枯草芽孢杆菌等其 而地衣芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆａｒｍｉｓ）是最具应用潜 他芽孢杆菌近亲所不同的是，地衣芽胞杆菌具有无自 力和价值的芽孢杆菌之一。不同于绝大多数芽孢杆菌 ［９１１］ ［１２１３］ 然感受态 和有特殊的限制性修饰系统 等特性， 在生长过程中严格需氧，地衣芽孢杆菌属兼性厌氧菌， 使得地衣芽孢杆菌的转化率十分低下。目前所报道的 所以对生长和发酵条件的适应性更强。这种内生孢子 地衣芽孢杆菌转化方法主要为原生质体转化 土壤细菌（ｅｎｄｏｓｐｏｒｅｆｏｒｍｉｎｇｓｏｉｌｂａｃｔｅｒｉｕｍ）目前被广泛 法［１０１１，１３１５］和电转化法［９，１６１７］。这两种方法分别基于 用于蛋白质的胞外表达，产物包括 淀粉酶、蛋白酶、 α ＰＥＧ介导ＤＮＡ与原生质体发生凝聚和瞬时高压电击 ［１２］ 脂肪酶、青霉素酶等，最高产量可达２５ｇ／Ｌ 。地衣芽 穿孔这两种不同机制，将外源ＤＮＡ转入经特殊处理后 孢杆菌也被用于生产多肽类抗生素（如杆菌肽）、有机 的地衣芽胞杆菌细胞，但总体而言阳性克隆的得率仍