金耳液体培养过程中几种胞外酶活性变化规律.docVIP

金耳液体培养过程中几种胞外酶活性变化规律 　　测定了金耳液体培养过程中，培养基中的淀粉酶、羧甲基纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、邻苯二酚氧化酶、愈创木酚氧化酶和漆酶的活性变化规律。结果表明，在整个培养期内，7种酶均有活性，但活性差异较大，产酶高峰也不尽相同。?? 　　金耳； 液体培养； 胞外酶活性； 高峰期?? 　　S567.350.1??A 　　 　　金耳??( Tremella aurantialba) 又名橙黄银耳、黄金银耳、脑耳，是异担子菌纲（Heterobasi??diomycetes），银耳目（Tremellales）, 银耳科(Tremellaceae)的名贵食药用真菌［1］，具有止咳化痰、补气养心、平肝健胃等功效，主要分布于我国云贵高原地区。我国从上个世纪八十年代开始进行金耳野生资源调查及驯化栽培研究［2］，现已实现了段木和代料栽培及液体发酵培养［3-5］。本文重点探讨了金耳液体培养过程中，培养基中胞外酶活性的变化规律，旨在为其营养生理研究提供一定的科学依据。?? 　　 　　1 材料与方法 　　 　　1.1?Σ牧? 　　1.1.1??供试菌株 　　金耳(Tremella aurantialba) 菌株购至东北食（药）真菌研究所，由辽宁大学生命科学学院微生物实验室保存。 　　1.1.2?Π胂宋?素制备［6］ 　　用4% NaOH、90 ℃浸泡小麦秸粉2 h，过滤得滤液，用浓盐酸调pH值至4.5后，加入等体积的乙醇，离心得沉淀，用无水乙醇洗涤沉淀两次，沉淀于80 ℃下烘干，即得浅黄色、粉末状的半纤维素。?? 　　1.1.3??果胶制备［7］ 　　称干燥粉碎（过100目）的桔皮40 g，用盐酸调pH 值至3，放于水浴锅中，80 ℃下搅拌（每??5 min 1次），90 min后过滤除去残渣，滤液浓缩至??300 mL后加等体积的95%乙醇，搅拌（5 min），静置2 h使果胶沉淀析出，滤液于24 ℃、3000 r/min（750×g）离心15 min，除去上清液，回收乙醇，沉淀放入干燥箱中干燥，得粗果胶。?? 　　1.2?ε嘌?基 　　麦麸斜面培养基：麦麸10%，马铃薯20%，蛋白胨0.5%，琼脂2%，pH自然。?? 　　液体发酵培养基：马铃薯20%，葡萄糖2%，硫酸镁0.1%，磷酸二氢钾0.1%，pH自然。?? 　　1.3?ε嘌?方法和样品制备 　　1.3.1??接种母液培养 　　取培养6 d的供试菌株斜面，轻轻刮下幼嫩菌丝片段, 接入液体培养基中(150 mL三角瓶中装80 mL培养液)，28 ℃、110 r/min恒温振荡培养5 d得母液。?? 　　1.3.2??菌丝培养 　　装有80 mL液体培养基的150 mL三角瓶中接入母液，接种量为2%，28 ℃、110 r/min恒温振荡培养16 d。?? 　　1.3.3?ρ?品制备 　　每2 d定时取1次发酵液样品，4 ℃、3500 r/min（1000×g）离心10 min，上清液即为粗酶液。?? 　　1.4?γ富钚圆舛? 　　1.4.1?Φ矸勖富钚圆舛? 　　试管中加入0.5%的可溶性淀粉（国产AR）溶液（用pH 5.8、0.1M乙酸盐缓冲液配制）??1.5 mL，加稀释10倍的粗酶液0.5 mL混匀，38 ℃水浴准确保温30 min，取出后立即加入按文献［8］的方法配制的DNS试剂1.5 mL，煮沸5min，取出，冷却后加入蒸馏水21.5 mL，混匀， 722型紫外可见分光光度计（中国上海）测??520 nm处的OD值；以煮沸??15 min灭活的酶液作对照，每组3个重复；酶活性以样品与底物反应30 min后光密度的改变值表示。?? 　　1.4.2??羧甲基纤维素酶活性测定 　　试管中加入0.5%的羧甲基纤维素钠（国产AR）溶液（用pH 4.6、0.1M柠檬酸盐缓冲液配制）1.5 mL，加稀释10倍的粗酶液0.5 mL，50 ℃水浴准确保温30 min，其后操作同淀粉酶活性测定。?? 　　1.4.3?Π胂宋?素酶活性测定 　　试管中加入0.5%的小麦秸半纤维素溶液（用pH 4.6、0.1M乙酸盐缓冲液配制）1.5 mL，加稀释10倍的粗酶液0.5 mL，50 ℃水浴准确保温30 min，其后操作同淀粉酶活性测定。?? 　　1.4.4??果胶酶活性测定 　　试管中加人1％的果胶溶液(用pH 4.5、??0.1M乙酸盐缓冲液配制)1.5 mL，加稀释10倍的粗酶液0.5 mL，于50 ℃反应30 min，其后操作同淀粉酶活性测定。?? 　　1.4.5?ζ崦富钚圆舛? 　　试管中加入3.36 mM的邻联甲苯胺（国产AR）溶液0.5 mL， 0.1 mol/L醋酸盐缓冲液(pH 4.6) 3.4