香蕉枯萎病拮抗放线菌8N―10分离鉴定及抑菌效果评价.docVIP

香蕉枯萎病拮抗放线菌8N―10分离鉴定及抑菌效果评价 　　摘要：为了分离对香蕉枯萎病病原菌有拮抗作用的放线菌，对菌株8N-10进行鉴定及测定抗菌活性。采用梯度稀释涂布平板法和平板对峙法分离拮抗菌，通过形态学特征、生理生化特征、16S rDNA序列测定及建树分析确定其分类学地位。用平板对峙的方法测定菌株对9种香蕉病原菌的拮抗作用，最后用盆栽试验的方法验证菌株8N-10对香蕉枯萎病的防效。结果表明，共分离出10株拮抗放线菌，初步鉴定拮抗性最好的菌株8N-10为诺尔斯氏链霉菌（Streptomyces noursei）对香蕉枯萎病病原菌4号小种的抑菌带达（15.5±0.65） mm。菌株8N-10对所有供试病原菌均具有不同程度的拮抗活性，表现出良好的广谱抗菌特性。其中，菌株8N-10对香蕉叶缘枯斑病病原菌（Alternaria musae）、粉蕉叶枯病病原菌（Pestalogiopsis sp.）、香蕉长形斑病病原菌（Curvularia fallax）的抑菌带均达到10 mm以上，显示了较强的抑制活性。菌株8N-10发酵液对香蕉枯萎病的相对防治率达92.708%，具有很好的防治效果。诺尔斯氏链霉菌8N-10对香蕉枯萎病的抑菌活性高，且其抑菌谱广，具有很好的应用前景。 　　关键词：香蕉枯萎病；拮抗菌；诺尔斯氏链霉菌 　　中图分类号： S476 　　文献标志码： A 　　文章编号：1002-1302（2016）04-0179-05 　　香蕉枯萎病，别称巴拿马病、黄叶病，是由尖孢镰刀菌古巴专化型引起的毁灭性土传维管束病害[1]。该菌分为4个生理小种[2]，其中4号小种侵染范围最广，几乎危害所有的香蕉品种。目前该病已经传遍我国广东、广西、福建、云南、海南等主要香蕉种植产区[3]，因此分离具有拮抗作用的放线菌，从而达到生物防治香蕉枯萎病的效果不失为一个很有意义的研究方向。生物防治是植物病虫害综合治理的重要手段，是保护生态环境、实现农业可持续发展的有力保障[4]。何欣等研究发现施用生物有机肥能显著促进香蕉植株生长，有效降低香蕉枯萎病的发病指数[5]。随着人们的不断探究，发现放线菌中的链霉菌对香蕉枯萎病菌的抑制作用非常明显[6]。秦涵淳等用分离出的2株放线菌发酵液进行盆栽试验，结果对香蕉枯萎病防效达86%以上，极显著高于恶霉灵药剂处理[7]。本研究对采集的香蕉根际土壤放线菌进行了分离筛选，选其中1株对香蕉枯萎病菌拮抗作用最强的的放线菌 8N-10 进行菌株鉴定，并测定该菌株对香蕉枯萎病的抑制效果以及菌株对其他香蕉病原菌的广谱拮抗性能。 　　1 材料与方法 　　1.1 试验材料 　　供试病原菌为香蕉枯萎病病原菌（Fusarium oxysporium f. sp. cubense 4，FOC4）、香蕉长形斑病菌（Curvularia fallax）、香蕉炭疽病菌（Colletotrichum musae）、香蕉大灰斑病菌（Curvularia lunata）、贡蕉眼斑病菌（Bioplaris oryzae）、香蕉果尖腐烂病菌（Deightoniella troulosa）、香蕉叶缘枯斑病菌（Alternaria musae）、贡蕉烟头病菌（Fusarium sp.）、粉蕉叶枯病菌（Pestalogiopsis sp.）均由笔者所在实验室保存[8]。供试土壤为海南省临高县南宝镇（109°51′18″E，19°47′3″N）香蕉园健康植株根际土壤。除去石子、根系等杂物，混匀后用无菌封口袋采集，于 4 ℃ 冰箱保存。培养基按照文献[9]的方法配制。放线菌分离和培养采用高氏一号琼脂培养基，倒平板前加入0005% 的重铬酸钾来抑制细菌和真菌的生长；用PDA培养基进行病原菌的培养以及拮抗试验；鉴定用培养基参照文献[10]的方法配制。 　　1.2 拮抗放线菌的分离与筛选 　　1.2.1 土壤放线菌的分离 称取土样5 g，加入45 mL无菌水，于28 ℃、200 r/min的摇床中振荡1 h，吸取上清液用无菌水逐级稀释成10-2、10-3和10-4浓度，每个浓度各吸取 100 μL 涂布到含重铬酸钾的高氏一号培养基平板上，封口膜封口后倒置培养在28 ℃的生化培养箱中，适时挑取不同形态的单个菌落分离划线，纯化并保存。 　　1.2.2 筛选拮抗放线菌 采用琼脂块平板对峙培养法[11]筛选拮抗放线菌，用打孔器截取直径5 mm的香蕉枯萎病病原菌菌饼于PDA平板中央，并在周围4个角距离病原菌边缘 2.5 cm 处接种待测菌株，对照只接病原菌菌饼，倒置培养在28 ℃的生化培养箱中，对照组菌丝铺满培养基时观察试验组抑菌情况，测量抑菌带的宽度。根据有无抑菌带筛出对FOC4有拮抗效果的菌株，连续接种5代进行复筛，选取抑菌带最宽的菌株进行下一步试验。