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Western blot（蛋白印迹法）详细步骤 组织的研磨 准备：研钵、研磨棒、EP管、药匙、液氮、液氮匙、自封袋、一次性手套、棉手套 步骤：①用研磨棒将装有冻存组织的EP管敲碎，取出组织，在研钵中盛满液氮，用力敲碎组织，研磨。 ②研磨过程中一旦液氮干了，立即加入液氮，保持研磨在液氮中进行，直至组织呈干粉状。 ③用在液氮中浸泡过的药匙将研磨好的粉末盛入新的EP管中。 ④装有组织粉末的EP管现在液氮中保存，待所有组织都研磨结束后装入自封袋，于-80℃保存。 注意：1.研钵使用前要用锡纸包口、研磨棒用锡纸包头，在烘箱中烘烤180℃至少3h以上。 2.组织研磨成粉末后待液氮全部挥发后再将组织粉末装管。 3.每种样品都最好留有副管，备用。 裂解提蛋白 准备：裂解液配制比例 RIPA:PMSF=1000：10=100：1 若需要加入蛋白酶抑制剂，则比例一般为1:1000（即1ml裂解液加1μl蛋白酶抑制剂） 步骤：①将RIPA和PMSF按比例混匀，加入到装有组织粉末的EP管中，一般加入300~500μl左右（浓度尽量高点）。 ②盖好盖子，在冰上裂解30~40min. ③到时间后于4℃，12000rpm离心10min，取上清液转移到新的离心管中，于-20℃保存。 注意：1.裂解液加入后用手指弹一下混匀，当加入量很少时，成粘稠状，有必要时应用枪头混匀。 BCA法测定蛋白浓度（BCA试剂盒） 准备：BCA试剂盒（BCA试剂A、BCA试剂B、蛋白标准液）、酶标板、酶标仪、摇床 步骤：①按1:15或1:30稀释待测样品，即取1μl样品+14μl水。 ②按下表在酶标仪中加入试剂，绘制标准曲线。 孔号 0 1 2 3 4 5 6 蛋白标准液（μl） 0 1 2 4 6 8 10 去离子水（μl） 10 9 8 6 4 2 0 蛋白含量（μg） 0 1 2 4 6 8 10 ③按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B（50:1）根据样品数量配制BCA工作液。 ④每个标准品孔加入200μl BCA工作液，样品孔加入待测样品10μl和200μl BCA工作液，充分混匀，在摇床上震荡30s，37℃放置30min，于492nm下测定OD值。 ⑤标准曲线以蛋白含量（μg）为横坐标，吸光度为纵坐标，根据样品的吸光度可以在标准曲线上查得相应的蛋白含量。 注意：1.标准曲线一般做两组，取最好的标准曲线计算。 2.蛋白浓度=（蛋白含量/总体积）×稀释倍数[μg/μl] 3.保证样品液中的蛋白含量相同（500μg/100μl）,则取10μl样品液中含有50μg蛋白。 4.样品液稀释液要再沸水浴中煮10min（可用微波炉加热），放凉至室温后于-20℃保存。 SDS蛋白质电泳 (一)、配胶 准备：凝胶液各成分、电泳板、制胶架、梳子 步骤:①选择适合电泳板（0.75mm:1.0mm:1.5mm），用自来水冲洗干净后再用蒸馏水冲洗，将玻璃板夹入玻璃板夹，注意底部对齐，夹好后卡到制胶架上。 ②首先配制分离胶（一般用12%的SDS分离胶），按分离胶配方配制，配胶时最后加APS和TEMED，迅速混匀，注意减少气泡的产生。 ③将配好的分离胶迅速加入玻璃板之间至梳子下约1cm处（绿色线处），不要有气泡。灌好胶后用蒸馏水覆盖胶层，加满蒸馏水至玻璃板顶端，以利于丙烯酰胺的聚合。室温静置约30min至胶层与水层检出现明显界限。若室温过低可将其置于37℃烘箱中。 ④配制浓缩胶（5%的Arcymalide浓缩胶），混匀，注意减少气泡产生。 ⑤带分离胶聚合后，倒掉上层水，将混匀的浓缩胶沿玻璃板壁小心加在分离胶上至较短玻璃板顶端，插好梳子，不能有气泡，室温静置20~30min至凝胶聚合。 注意：1.夹好玻璃玻璃板后用水检查其是否漏水。 2.12%分离胶配方： 不同体积（ml）凝胶液各成分所需体积（ml） 溶液成分 5 10 15 20 25 30 H2O 1.6 3.3 4.9 6.6 8.2 9.9 30%Arcylamide 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 1.0M Tris-HCL(PH8.8) 1.3 2.5 3.8 5.0 6.3 7.5 10%SDS 0.05 0.1 0.15 0.20 0.25 0.30 10%APS 0.05 0.1 0.15 0.20 0.25 0.30 TEMED 0.002 0.004 0.006 0.008 0.010 0.012 3.SDS浓缩胶配方（5%Arcylamide） 不同体积（ml）凝胶液各成分所需体