稀释液中添加海藻糖对绒山羊冻精精清中酶活性的影响--毕业论文设计.docVIP

前 言 海藻糖(Trehalose. TH)是一种典型的应激代谢物，能在高温、高寒、高渗透压及干燥等恶劣环境下，于细胞表面形成独特的保护膜，有效地保护生物分子的结构不被破坏，从而维持生命体的生命过程和生物特征，且外源性海藻糖与内源性海藻糖一样，对生物体和生物大分子具有良好的非特异性保护作用，是一种有效的非善透性抗冻保护剂，已被广泛应用于各种生物活性物质和细胞的低温和冷冻保存。 廖清华 (2009) [1]海藻糖和维生素C对猪精液冷冻保存效果的影响的试验中试验比较了在冷冻稀释液中添加不同浓度海藻糖(0.025,0.05,0.1 mol/L)以及添加10 mg/L维生素C对猪精液冷冻保存效果的影响。结果:(1)添加0.025 mol/L海藻糖组的精子冻后活率与复苏率分别跟对照组相比无显著差异(P0.05),但添加浓度为0.05,0.1 mol/L的海藻糖组的精子活率和复苏率显著低于对照组(P0.05)。(2)在猪精液冷冻保存稀释液中,添加维生素C组的精子冻后活率和复苏率极显著高于对照组(P0.01)。表明在猪精液冷冻液中,添加0.025,0.05,0.1 mol/L 3种不同浓度的海藻糖对猪精液没有起到保护作用,其中后两者对之有降低的作用;而添加10 mg/L维生素C可取得较好的冷冻保存效果。 金一（2005）[2]在稀释液中添加海藻糖探讨海藻糖对猪精子冷冻效果以及精子内活性氧(ROS)的含量影响。试验分对照组和4个海藻糖处理组(0.025,0.05,0.1和0.2 mol/L)。精子冷却后,添加0.1 mol/L海藻糖处理组精子活力显著(P0.05)高于对照组,而精子内和稀释液中各组间ROS发生量都没有显著的差异。精子冷冻解冻后,添加0.05 mol/L海藻糖处理组的精子活力显著(P0.05)高于对照组;添加0.05 mol/L和0.1 mol/L海藻糖处理组的精子生存率显著(P0.05)高于对照组;添加0.1 mol/L海藻糖处理组顶体完整的精子百分比显著(P0.05)高于对照组;4个海藻糖处理组膨胀精子百分比 羊精液冷冻生产技术的应用是家畜人工授精技术一次重要的革新对于充分发挥优良种公羊在育种工作中的作用，加速养羊业的发展具有十分重要的意义。海藻糖就是一种维持渗透压的非渗透性冷冻保护剂，有不少研究报道说在猪、绵羊的冷冻精液稀释液中添加海藻糖对精子抵抗冷冻损伤具有一定作用，而关于山羊在这方面的报道却很少。本试验比较在稀释液中添加不同浓度的海藻糖对晋岚绒山羊冻精精清中酶活性的影响，探讨其作用机制，为海藻糖在绒山羊冻精稀释液中的应用提供依据。 1 材料与方法 1.1 试验动物 选用岢岚种羊场6只体格健康、性欲旺盛的成年晋岚绒山羊种公羊。 1.1.1 处理 1组（对照）：100%TCG＋0%海藻糖溶液； 2组：75%TCG＋25%海藻糖溶液； 3组：50%TCG＋50%海藻糖溶液； 4组：25%TCG＋75%海藻糖溶液 5组：0%TCG＋100%海藻糖溶液 1.1.2 液体的配制 （1）海藻糖溶液(浓度为141.87mg/ml)：8.5122克海藻糖加蒸馏水配成60ml； （2）TCG稀释液：Tris（T）2.7252克，柠檬酸（C）1.5636克，葡萄糖（G）0.4872克加蒸馏水配成60ml；SDS溶液(浓度为0.35mg/ml)：0.021克SDS加蒸馏水配成60ml。 1.2试验方法 1.2.1 采精 用假阴道法常规采集精液，合格者进行稀释和冷冻。 1.2.2 稀释、冷冻与解冻 容器放在37℃水浴中预热，把合格的精液混合，等分为5等分，取20ml的试管按1:4的比例将精液分别缓慢加入5种等温稀释液稀释，将装有稀释液的试管放入装有300ml同温水的500ml烧杯中，稀释液的液面要低于烧杯中的水面，然后将溶液分装到0.25ml的PVC细管中，置于3～5℃冰箱2小时，取出细管放入纱布袋中，在离液氮面2～3cm处预冻3分钟，然后放入液氮中保存。 将冷冻细管从液氮罐中取出迅速放入37～40℃水浴中解冻，待细管精液变色后取出进行检测。 1.2.3 精清中酶活性的测定 根据试剂盒推荐的方法来测定。 1.2.3.1谷草转氨酶（GOT）(LDH)活性的测定 A 操作步骤：将精液3000转离心15分钟取上清液即是精清。 ①在标准管中加入2微mol/ml丙酮酸标准液0.01ml。 ②在标准管、标准空白管、测定空白管中分别加入蒸馏水0.05ml、0.06ml、0.05ml。 ③在测定管、测定空白管中各加入精清0.01ml。 ④在标准管、标准空白管、测定管、测定空白管中各加入基质缓冲液0.25ml。 ⑤在测定管中加入辅酶I溶液0.05ml。混匀，37℃水浴15分钟。 ⑥在标准管、标准空白管、测定管、测定空白管中各加2，4-二硝基苯