基于RNA-Seq技术的牦牛体外受精胚胎发育转录组分析-中国农业科学.PDF

中国农业科学 2018,51(8):1577-1589 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2018.08.015 基于RNA-Seq技术的牦牛体外受精胚胎发育转录组分析 1 1 1 1 1 1 2 2 1 字向东 ，罗斌 ，夏威 ，郑玉才 ，熊显荣 ，李键 ，钟金城 ，朱江江 ，张正帆 1 2 （西南民族大学生命科学与技术学院, 成都 610041 ； 西南民族大学青藏高原研究院, 成都 610041 ） 摘要：【目的】探明不同发育阶段牦牛体外受精（IVF）胚胎的转录组差异，了解差异表达基因（DEG）在功 能、分类和代谢通路的差异，为揭示牦牛早期胚胎发育调控机制，促进牦牛胚胎体外生产技术的发展提供理论基 础。【方法】以 IVF 技术生产的牦牛 2-细胞、4-细胞、8-细胞、桑椹胚和囊胚 5 个发育阶段的胚胎为样本分别提 取总 RNA，采用 Smart-Seq2 扩增技术构建 5 个测序文库，应用 HiSeqTM 2500 高通量测序技术进行转录组测序，对 获得的有效序列进行功能注释及相关生物信息学分析。【结果】牦牛 IVF 后的卵裂率和囊胚率分别为 69.3%和 26.2%。2-细胞、4-细胞、8-细胞、桑椹胚和囊胚5个发育阶段的牦牛胚胎Clean reads为47 355 570—50 855 888 条，其中有85.65%—90.02%的reads能比对到牦牛参考基因组序列上；8-细胞的胚胎比对上的转录本最多（14 893）， 而囊胚比对上的转录本最少（9 827）。牦牛胚胎转录本主要有5种可变剪接类型，转录起始区域可变剪接（TSS） 和转录结束区域可变剪接（TTS）所占比例最大；牦牛2-细胞、4-细胞、8-细胞、桑椹胚和囊胚基因组分别有116 601、234 131、196 420、70 841和94 840 个位点存在单核苷酸多态性（SNP）。在4-细胞、8-细胞、桑椹胚、囊 胚期开始表达的基因分别有1 221、1 116、142和564个；随着胚胎发育的进行，BMP15、KIT、GDF9、STAT3、ZP3 和 ZP4 等母源基因的表达量逐渐减少，而 SARS、IL18、ACO2、TXN2、ATP5B、PCGF4、UBE3A、MAPK13、SNURF 和 JUP 等胚胎基因的表达量则逐渐增加。以|log ratio| ≥1 且 Q-value ＜ 0.05 为筛选标准，在 2-细胞和 4-细胞 2 胚胎、4-细胞和8-细胞胚胎、8-细胞胚胎和桑椹胚以及桑椹胚和囊胚比对中分别筛选到6 922、7 601、8 071和 10 555个DEGs。GO分析表明，4个发育阶段的DEGs归类注释都涉及生物过程（BP）、细胞组分（CC）和分子功能 （MF）3大类62个二级条目。通过KEGG pathway数据库分析，2-细胞和4-细胞期胚胎的DEGs参与到308 条通路 中，显著富集剪接体、RNA 转运和泛素介导的蛋白水解等 11 条通路；4-细胞和 8-细胞胚胎的 DEGs 参与到 310 条 通路，显著富集嗅觉转导、神经活性配体-受体互作和核苷酸切除修复等9 条通路；8-细胞期胚胎和桑椹胚的DEGs 参与到 316 条通路，显著富集嗅觉转导、泛素介导的蛋白水解和神经活性配体-受体互作等 10 条通路；桑椹胚和 囊胚的 DEGs 参与到 315 条通路，显著富集剪接体和 RNA 转运 2 条通路。【结论】利用高通量测序技术对牦牛 IVF 胚胎不同发育阶段的转录组进行测序和分析，揭示了牦牛胚胎发育不同阶段差异表达基因的数量，获得了差异表 达基因的功能、分类和代谢通路。为丰富牦牛胚胎转录组信息，揭示牦牛胚胎发育分子调控机制及完善其胚胎体 外培养技术研究奠定基础。